本发明涉及一种固定化酪氨酸酚裂解酶及转化方法与应用，属于酶催化领域。
背景技术：
左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-l-ananine，简称l-dopa)的化学名称为3,4-二羟基苯基丙氨酸，其结构式为：
作为一种重要的生物活性物质，l-dopa是从l-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。
上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成l-dopa的研究。为了提高l-dopa产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成l-dopa的工艺方法进行了大量研究。
酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenollyase，tpl，e.c.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，该酶分子量约200kda，是一个四聚体酶。tpl酶以磷酸吡哆醛(pyridoxal-phosphate，plp)为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，tpl可以催化l-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在tpl催化下生成l-dopa。左旋多巴的前体在较高浓度时对酶活都有抑制作用，其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外，还会导致酶的不可逆失活，反应条件难以控制，副产物多，l-dopa的产率低。
印度r.krishnavenivandanarathod等人利用真菌acremoniumrutilum转化l-酪氨酸至l-多巴，酪氨酸酶比活达1095u/mg。但目前产能较低，只有0.89g/l。
巴基斯坦ikram-ul-haq等人对产酪氨酸酶的aspergillusoryzae进行紫外诱变，诱变株最大产量达1.28g/l。
埃及doaaa.r.mahmoud·magdaa.elbendary利用egyptianhalophilicblackyeast的酪氨酸酶转化生成l-dopa，产量为66μg/ml。
韩国研究人员使用酪氨酸酶进行转化时，利用电取代还原试剂，将多巴醌(dopaquinone)还原为l-多巴，使转化率达95.9，生产强度47.27mg/l*h。
也有一些利用自然界中的细菌，如escherichia、proteus(变形菌属)、stizolobiumhassjoo和erwinia(欧文氏菌属)等，来合成l-dopa，如左旋多巴酶法合成综述报道，tpl大肠杆菌基因工程菌转化30h，转化生成29.6g/l的l-dopa。又如，jang-younglee等人克隆来源于escherichiacoliw(atcc11105)的对羟基苯乙酸-3-羟基化酶(p-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase，phah)，转化l-酪氨酸为l-dopa，产物累积至10g/l。研究者发现这些重组菌株虽然tpl的表达量高于野生菌株，但最终的l-dopa合成能力却没有明显提高甚至低于野生菌株。这可能因为要获得较高的l-dopa合成能力，菌株除了具备tpl高活性外，还要有相对完善的底物、产物出入细胞膜的转运机制以及对底物邻苯二酚抑制酶活的耐受力等。总体来说，反应条件难以控制，稳定性差，副产物多，l-dopa的产率低。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种工程菌；鉴定为大肠埃希氏菌，命名为大肠埃希氏菌trx-tpl(escherichiacolitrx-tpl)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学武昌珞珈山，保藏日期为2017年6月8日，保藏编号为cctccm2017684。
本发明的目的是提供固定化酪氨酸酚裂解酶的方法，并利用该固定化酶进行转化生产左旋多巴。
上述所得到固定化酪氨酸酚裂解酶，用于在底物溶液存在条件下，转化产生l-多巴。
具体操作步骤包括：
(1)挑单菌落接种到含lb培养基的试管中，加氨苄青霉素(100mg/l)30-37℃，220rpm，培养12-16h，得到一级种子；
(2)将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，30-37℃，200-250rpm，培养2-5h，加iptg至终浓度0.6mm，28-32℃，180-220rpm，培养10-12h；所述发酵培养基组分如下：胰蛋白胨12g/l、酵母提取物24g/l、甘油5g/l，磷酸二氢钾2.31g/l、三水磷酸氢二钾16.43g/l；
(3)离心收菌，得到菌体，压榨破胞，加壳聚糖溶液絮凝，高速离心，获得上清酶液，加入固定化载体ep200，25℃搅拌混合24h，三足式离心收集固定化酶。用50mm的磷酸钾缓冲液(ph8.0)，多次洗涤，过滤，获得固定化酶。
(4)固定化酶20g，加入底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液包括14-16g/l的丙酮酸钠、10-12g/l的邻苯二酚、40-45g/l的氯化铵、2-5g/l的亚硫酸钠、1-3g/l的edta，调ph7.5-8.5。
本发明的有益效果如下：本发明将酪氨酸酚裂解酶与ep200交联固定，可以有效提高表达的酶的稳定性，尤其是热稳定性、耐受邻苯二酚的稳定性，可以在提供相关底物下，延长转化合成左旋多巴的时间，增加底物浓度，工艺简单，成本低廉，产率高，具有工业化生产的应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1：发酵产生酪氨酸酚裂解酶
lb培养基：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物0.5g/l、氯化钠10g/l、纯水。
发酵培养基：胰蛋白胨12g/l、酵母提取物24g/l、甘油5g/l，磷酸二氢钾2.31g/l、三水磷酸氢二钾16.43g/l、纯水。
1)挑单菌落接种4mllb培养基试管中，加氨苄青霉素(100mg/l)，37℃，220rpm，培养12h，得到一级种子；
2)一级种子接种到100ml的发酵培养基的摇瓶中，37℃，220rpm，培养4h，加iptg至终浓度1mm，28℃，220rpm，培养12h；
3)步骤(2)中菌液离心收菌体，放置-20℃冰箱。
实例2：酪氨酸酚裂解酶的提取与固定
1)菌体加3倍体积的水，用高压均质机压榨破胞两次；
2)高速离心，获得上清酶液；
3)酶液加入菌体量50％-200％的固定化载体ep200，20-30℃震荡混合24h；
4)过滤，收集固定化粗酶，用磷酸钾缓冲液(20-100mm，ph7-8.5)洗涤多次，过滤，得固定化酶；
实例4：固定化酪氨酸酚裂解酶转化产生l-多巴
1)1l底物溶液：14g/l的丙酮酸钠、10g/l的邻苯二酚、40g/l的氯化铵、2g/l的亚硫酸钠、1g/l的edta，调ph8.0；
2)固定化酶10-40g，加入1l底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；
3)每半小时添加一次底物(等量的丙酮酸钠和领苯二酚)，控制两种底物底物浓度不高于10g/l；
4)当邻苯二酚残留浓度至1g/l以下，停止反应，l-多巴浓度累积至110g/l以上。
5)反应料液过滤网，分离固定化酶活反应液及产物，截留回收固定化酶；
6)滤出的反应产物一次精制获得产品。