一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术及应用领域，具体涉及一种与菊花脑抗蚜性相关的mirna160a；本发明还涉及基于trv-vbms技术沉默菊花脑内源mirna从而鉴定其功能的技术。

背景技术

菊花脑(chrysanthemumnankingense)为菊科菊属二倍体野生种，原产我国(张莉俊等，2009)，在功能基因组研究中占据重要的位置，然而菊花脑缺乏稳定的遗传转化体系，严重制约了基因功能研究。蚜虫是一种常见的刺吸式昆虫，主要取食植物韧皮部汁液，消耗植物养分，直接影响植物生长；其分泌的蜜露还诱发煤污病，影响光合作用，此外蚜虫还传播病毒。上述危害严重影响菊花脑观赏品质及食用价值。

mirna是近几年来较受关注的一类调控基因表达的非编码rna。mirna是由大约22个核苷酸组成的小rna分子(berezikovetal.,2006)，调控着植株生长发育的各个方面，包括叶片形态建成、花器官发育等(chenetal.,2005)。另外，mirna在植物响应逆境胁迫反应中也发挥着不可替代的作用。mirna的作用机制主要表现为与靶基因mrna近乎完美地互补结合，介导对其的剪切降解和翻译抑制，植物中大多表现为前者(barteletal.,2004)。

基于病毒的mirna沉默(virus-basedmicrornasilencing，vbms)，是指携带一段寄主植物目的mirna模拟靶标sttm序列的病毒载体侵染植株引发寄主内源mirna的沉默，从而实现对该mirna的功能鉴定(senthil-kumar&mysore,2011)。sttm含有两个target-mimic序列，其间由一段48至88个核苷酸长的序列连接(shaetal.,2014)。sttm的表达可针对性使两个mirna降解。

近年来vbms技术已成为一种重要的反向遗传学工具用于mirna功能的研究，与稳定遗传相比，vbms技术快速有效，能及时大量地搜索、查找与研究目的有关的mirna，并能在短时间内(2-4周)产生表型(shaetal.,2014)；其次，不需要经过费时费力的植物转基因过程，特别是有助于对那些敲除后可能引起细胞死亡的mirna功能的鉴定，以及无法进行转基因的植物种类；第三，trv病毒(烟草脆裂病毒)能感染的植物范围相对较广(macfarlaneetal.,1999)，已成功应用于多种植物基因功能研究中，如烟草中，利用vbms技术瞬时沉默mir165/166后，植株顶端优势丧失，而mir172瞬时沉默后引起不同程度的花发育缺陷；番茄中，vbms介导的mir319瞬时沉默后，植株叶片变小，且叶型简化(shaetal.,2014)。

参考文献：

张莉俊，戴思兰.菊花种质资源研究进展[j].植物学报,2009,44(5):526-535.

bartel,d.p.(2004a)micrornas:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.cell,116,281–297.

berezikove.,cuppene.,plasterkr.h..(2006)approachestomicrornadiscovery.naturegenetics,38,s2-s7.

chenx..(2005)micrornabiogenesisandfunctioninplants.febsletters,579,5923-5931.

macfarlanes.a.,vassilakosn.,brownd.j..(1999)similaritiesinthegenomeorganizationoftobaccorattlevirusandpeaearly-browningvirusisolatesthataretransmittedbythesamevectornematode.journalofgeneralvirology,80(pt1),273-276.

senthil-kumarm.,mysorek.s..(2011)newdimensionsforvigsinplantfunctionalgenomics.trendsinplantscience,16,656-65.

shaa.,zhaoj.,yink.,tangy.,wangy.,weix.,hongy.,liuy..(2014)virus-basedmicrornasilencinginplants.plantphysiology,164,36.

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种与植物抗蚜性相关的mir160a，并提供trv-vbms技术沉默菊花脑内源mirna的方法，并利用此mirna及trv-vbms技术提高菊花脑的抗蚜性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种与菊花脑抗蚜性相关的mir160a，具有如seqidno.1所示的序列。

上述的与菊花脑抗蚜性相关的mir160a在提高植物抗蚜性或培育抗蚜转基因植物中的应用。

sttm160a序列片段，具有如下(a)～(c)中任一所述的核苷酸序列：

(a)如seqidno.2所示的核苷酸序列；

(b)如seqidno.2所示的核苷酸序列的互补序列；

(c)具有seqidno.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸所获得的核苷酸序列，且与seqidno.2所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

上述的sttm160a序列片段在构建基于烟草脆裂病毒诱导mirna沉默载体中的应用。

含有上述sttm160a序列片段的重组表达载体、转基因细胞系或转基因工程菌。

上述的重组表达载体，该重组表达载体是基于烟草脆裂病毒诱导mirna沉默的载体，为将上述的sttm160a序列片段插入到trv2e载体的psti位点间通过lic方法得到的植物表达载体trv2e-sttm160a。

上述的转基因工程菌，该转基因工程菌通过将上述的植物表达载体trv2e-sttm160a转化农杆菌感受态获得。

上述的sttm160a序列片段、重组表达载体和转基因工程菌在提高植物抗蚜性、培育抗蚜性转基因作物或快速鉴定菊花脑mir160a功能中的应用。

一种培育抗蚜转基因植物的方法，通过沉默植物中的mir160a增强植物对蚜虫的抗性。所述的抗蚜转基因植物为菊花脑。优选的，该方法为将含有内源目的mir160a结合位点的如seqidno.2所示sttm160a序列片段的trv2e病毒沉默表达载体质粒瞬时转化植株，诱导植株内源目的mirna发生沉默，培育出具有抗蚜性的转基因植物。所述的内源目的mirna为如seqidno.1所示的mir160a。

一种快速鉴定菊花脑mirna功能的方法，将含有内源目的mirna结合位点的sttm序列片段的trv2e-sttm160a病毒沉默表达载体质粒瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的mirna发生沉默，从而鉴定该内源目的mirna的功能。

优选的，所述的含有内源目的mirna结合位点的sttm序列片段的trv2e病毒沉默表达载体质粒为上述的植物表达载体trv2e-sttm160a；通过植株抽真空法将上述的植物表达载体trv2e-sttm160a瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的mirna发生沉默，从而鉴定该内源目的mirna的功能，统计目的mirna沉默植株虫口数目。

上述的快速鉴定菊花脑mirna功能的方法，具体包括如下步骤：

(1)构建植物表达载体trv2e-sttm160a：以人工合成的一段由48个核苷酸组成的link序列seqidno.3为模板，以sttm序列引物sttm160a-f:seqidno.4和sttm160a-r:seqidno.5为引物进行pcr扩增反应，得到目的片段，将纯化产物和trv2e载体分别进行psti(fermentas,usa)单酶切，然后在t4dna(takara,japan)聚合酶作用下，分别对酶切后的trv2e载体和sttm160a进行dttp和datp加尾处理，回收目的片段之后进行lic法连接，将连接产物转化dh5α感受态，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体trv2e-sttm160a构建成功，将trv2e-sttm160a通过电转化转入农杆菌gv3101；

(2)制备侵染液：从添加了100mg/lrif和50mg/lkan的lb平板上挑取含有植物表达载体trv2e-sttm160a、trv2e-gfp对照载体、trv1载体的阳性农杆菌gv3101单克隆，分别在添加了100mg/lrif，10mmmes，20μmacetosyringone(乙酰丁香酮)和50mg/lkan的lb液体培养基中进行培养至od600为1.5，然后离心去上清收集各菌体，采用等体积侵染缓冲液重悬各菌体并调节od600至1.5，黑暗静置后将trv1与trv2e-gfp或trv2e-sttm160a悬浮菌液等体积混合，用作菊花脑幼苗侵染液；所述侵染缓冲液的配方为10mmmes，200μmacetosyringone，10mmmgcl2水溶液，ph＝5.6；

(3)将步骤(2)制备的侵染液利用抽真空方式侵染菊花脑播种苗，直至植株被农杆菌菌液完全浸润；

(4)转化后培养：将侵染的植株用自来水冲洗后定植，并用保鲜膜保湿，置于黑暗中培养1d后，于光照培养箱中正常管理(16h/8h光周期、23℃/18℃昼夜温度、相对湿度70％)；

(5)转化株表型观察：侵染后1周，在tanonuv-100手提式紫外灯(catalogno.200-1300(365/365nm))照射下进行真叶中gfp荧光信号检测，筛选阳性苗，并拍照记录。筛选出的阳性植株用于进一步实验；

(6)内源目的片段cp(编码病毒外壳蛋白)和sttm160a序列的rt-pcr检测：取在紫外灯照射下有绿色荧光信号的菊花脑植株真叶提取rna，并消化基因组dna，用trv特异反转录引物(trv-rt):seqidno.6进行反转录得到cdna，然后以cp-f：seqidno.7和cp-r：seqidno.8为cp引物检测cp基因的表达；以sttm160a-f:seqidno.9和sttm160a-r:seqidno.10为sttmqrt-pcr检测引物检测sttm160a序列的表达，取样植株用于下一步实验。

(7)内源mirna表达的qrt-pcr检测：将步骤(6)提取的rna用反转录引物oligo(dt)18:seqidno.11和目标mirna特异反转录引物mir160a-rt:seqidno.12进行反转录，以mir160a-f:seqidno.13和mir160a-r:seqidno.14为mir160aqrt-pcr检测引物检测目标mirna的表达量，以cnef1α-f:seqidno.15和cnef1α-r:seqidno.16为cnef1α引物检测内参基因cnef1α的表达量。

上述的快速鉴定菊花脑mirna在提高抗蚜性应用的鉴定方法，优选为选取长势一致的3～4片叶龄的trv2e-sttm160a阳性植株和trv2e-gfp对照植株进行蚜虫接种，每株接种5头菊姬长管蚜2龄若虫，两周后统计植株上蚜虫的数目。

本发明的实验证明，在蚜虫敏感植株菊花脑中，蚜虫取食前期(3h、6h和12h)，mir160a表达量上升，说明mir160a的表达响应蚜虫取食，在抗蚜性提高的trv2e-sttm160a阳性植株中mir160a表达水平显著低于trv2e-gfp对照阳性植株，说明mir160a在菊花脑的抗蚜性中担任重要作用。

本发明的优点在于，将含有内源目的mirna结合位点的sttm序列片段通过trv-vbms技术法沉默菊花脑内源mirna，采用播种苗抽真空法将上述的植物表达载体trv2e-sttm瞬时转化菊花脑，其具有快速，高通量，低成本，易于操作与实现等优势，为规模化开展菊花脑mirna功能研究提供依据，避免了因缺乏稳定的遗传转化体系而严重制约的基因功能研究。本发明mir160a的表达受到蚜虫取食的调节，说明其在菊花脑的抗蚜性中担任重要作用，基于此，可利用该mirna进行抗蚜转基因作物的培育，进而对于提高作物的抗蚜性。

附图说明

图1：蚜虫取食下菊花脑中mir160a的表达模式。

图2：植物重组表达质粒trv2e-sttm160a片段图谱。

图3：qrt-pcr检测trv2e-gfp对照和trv2e-sttm160a阳性植物中mir160a表达水平。

trv2e-gfp：空载对照阳性株系；trv2e-sttm160a：mir160a沉默阳性株系

图4：mir160a沉默植株抗蚜性鉴定。

trv2e-gfp：空载对照阳性株系；trv2e-sttm160a：mir160a沉默阳性株系

具体实施方式

下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：

在以下实施例中，除非特殊说明，所涉及的载体和实验材料均为本领域技术人员所公知的。

实施例1：菊花脑在蚜虫取食下mir160a表达模式分析

(1)蚜虫处理：取长势一致的菊花脑6～8叶龄播种苗，在每株植株从上往下数第二片全展叶上接种20头菊姬长管蚜2龄若虫，接种蚜虫前预先饥饿处理3h，接种后叶片罩上高2cm，直径5cm的微虫笼，以防蚜虫逃逸，取样时间点为接种后0h、3h、6h、12h、24h。每个时间点每个生物学重复取3株植物的叶片，3次生物学重复。取样后叶片用液氮速冻，并于-80℃保存，分别提取叶片的rna。

(2)荧光定量pcr检测：将步骤(1)提取的rna用oligo(dt)18:seqidno.11和目标mirna特异反转录引物mir160a-rt:seqidno.12进行反转录，以mir160a-f:seqidno.13和mir160a-r:seqidno.14为引物检测目标mir160a的表达量(经测序mir160a的序列如seqidno.1所示)，以cnef1α-f:seqidno.15和cnef1α-r:seqidno.16为引物检测内参基因cnef1α的表达量。

实施例2：菊花脑mir160a瞬时沉默转化

(1)构建植物表达载体trv2e-sttm160a：以人工合成的一段由48个核苷酸组成的link序列seqidno.3为模板，以sttm160a-f:seqidno.4和sttm160a-r:seqidno.5为引物进行pcr扩增反应，得到目的片段sttm160a序列片段(如seqidno.2所示)，将纯化产物和trv2e载体分别进行psti(fermentas,usa)单酶切，然后在t4dna(takara,japan)聚合酶作用下，分别对酶切后的trv2e载体和sttm160a进行dttp和datp加尾处理，回收目的片段之后进行lic法连接，将连接产物转化dh5α感受态，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体trv2e-sttm160a构建成功，将trv2e-sttm160a通过电转化转入农杆菌gv3101；

(2)制备侵染液：从添加了100mg/lrif和50mg/lkan的lb平板上挑取含有植物表达载体trv2e-sttm160a、trv2e-gfp对照载体、trv1载体的阳性农杆菌gv3101单克隆分别在添加了100mg/lrif，10mmmes，20μmacetosyringone(乙酰丁香酮)和50mg/lkan的lb液体培养基中进行培养至od600为1.5，然后离心去上清收集各菌体，采用等体积侵染缓冲液重悬各菌体并调节od600至1.5，黑暗静置后将trv1与trv2e-gfp或trv2e-sttm160a悬浮菌液等体积混合，用作菊花脑幼苗侵染液。侵染液为两组混合液：对照组为trv2e-gfp+trv1的混合液；处理组为trv2e-sttm160a+trv1的混合液。所述侵染缓冲液的配方为10mmmes，200μmacetosyringone，10mmmgcl2水溶液，ph＝5.6；

(3)将步骤(2)制备的侵染液利用抽真空方式侵染菊花脑播种苗(只含两片子叶)，直至植株被农杆菌菌液完全浸润；

(4)转化后培养：将侵染的植株用自来水冲洗后定植，并用保鲜膜保湿，置于黑暗中培养1d后，于光照培养箱中正常管理(16h/8h光周期、23℃/18℃昼夜温度、相对湿度70％)；

(5)转化株表型观察：侵染后1周，在tanonuv-100手提式紫外灯(catalogno.200-1300(365/365nm))照射下进行真叶中gfp荧光信号检测，筛选阳性苗，并拍照记录。筛选出的阳性植株用于进一步实验；

(6)内源目的片段cp(编码病毒外壳蛋白)和sttm160a序列的rt-pcr检测：取在紫外灯照射下有绿色荧光信号的菊花脑植株真叶提取rna，并消化基因组dna，用trv特异引物(trv-rt):seqidno.6进行反转录得到cdna，然后以cp-f：seqidno.7和cp-r：seqidno.8为引物检测cp基因的表达；以sttm160a-f:seqidno.9和sttm160a-r:seqidno.10为引物检测sttm160a序列的表达，取样植株用于下一步实验。

(7)内源mir160a表达的qrt-pcr检测：将步骤(6)提取的rna用oligo(dt)18:seqidno.11和目标mirna特异反转录引物mir160a-rt:seqidno.12进行反转录，以mir160a-f:seqidno.13和mir160a-r:seqidno.14为引物检测目标mir160a的表达量，以cnef1α-f:seqidno.15和cnef1α-r:seqidno.16为引物检测内参基因cnef1α的表达量。

(8)抗蚜性鉴定：选取长势一致的3～4片叶龄的沉默株系接种蚜虫，进行抗蚜性鉴定。结果显示，接种5头菊姬长管蚜2龄若虫的trv2e-gfp对照和trv2e-sttm160a阳性植株，两周后植株上的蚜虫数目显著差异，trv2e-gfp对照阳性植株上蚜虫数目平均为48.1头，而trv2e-sttm160a阳性植株上的蚜虫数目平均为24.3头，表明沉默mir160a使菊花脑对蚜虫的抗性增强。

所述mir160a的序列如seqidno.1所示；所述sttm160a序列片段如seqidno.2所示；所述的link序列片段如seqidno.3所示；所述的sttm序列引物包括上游引物sttm160a-f:seqidno.4和下游引物sttm160a-r:seqidno.5；所述的trv反转录引物trv-rt:seqidno.6；所述的cp引物包括上游引物cp-f:seqidno.7和下游引物cp-r:seqidno.8；所述的sttmqrt-pcr检测引物包括上游引物sttm160a-f:seqidno.9和下游引物sttm160a-r:seqidno.10；所述的反转录引物oligo(dt)18:seqidno.11；所述的mirna反转录引物mir160a-rt:seqidno.12；所述的mir160aqrt-pcr检测引物包括上游引物mir160a-f:seqidno.13和下游引物mir160a-r:seqidno.14；所述的cnef1α引物包括上游引物cnef1α-f：seqidno.15和下游引物cnef1α-r:seqidno.16。其中基因片段的序列如下所示：

mir160a序列(seqidno.1)：tggcatacagggagccaggca。

sttm160a序列片段核苷酸序列为seqidno.2(5’---3’):

cgacgacaagacccttggcatacaggctagagccaggcagttgttgttgttatggtctaatttaaatatggtctaaagaagaagaattggcatacaggctagagccaggcaagggctcttctcctc。

link序列片段核苷酸序列为seqidno.3(5’---3’)：

gttgttgttgttatggtctaatttaaatatggtctaaagaagaagaat。

sttm160a-f:seqidno.4(5’---3’)：

cgacgacaagacccttggcatacaggctagagccaggcagttgttgttgttatgg。

sttm160a-r:seqidno.5(5’---3’)：

gaggagaagagcccttgcctggctctagcctgtatgccaattcttcttctttagaccatrv-rt:seqidno.6(5’---3’)：gggcgtaataacgcttacgtaggc

cp-f:seqidno.7(5’---3’)：ctgacttgatggacgattctt

cp-r:seqidno.8(5’---3’):tgttcgccttggtagtagta

sttm160a-f:seqidno.9(5’---3’):ggtctaaagaagaagaatatgtccc

sttm160a-r:seqidno.10(5’---3’):gcctttgtaaccatcatcact

oligo(dt)18:seqidno.11(5’---3’):tttttttttttttttttt

mir160a-rt:seqidno.12(5’---3’):gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactggcat

mir160a-f:seqidno.13(5’---3’):atgtttgcctggctccctgt

mir160a-r:seqidno.14(5’---3’):agtgcagggtccgaggtat

cnef1α-f:seqidno.15(5’---3’):ttttggtatctggtcctggag

cnef1α-r:seqidno.16(5’---3’):ccattcaagcgacagactca

本发明的技术方案为通过蚜虫接种与荧光定量发掘抗蚜性相关mir160a，及基于trv-vbms技术快速鉴定菊花脑mirna160a功能的方法，通过使用真空泵对菊花脑播种苗进行抽真空，通过植株抽真空法将含有内源目的mirna结合位点的sttm序列的trv病毒沉默表达载体质粒如trv2e-sttm载体瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源mirna发生沉默，从而鉴定mirna功能。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种与菊花脑抗蚜性相关的mirna160a及其应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggcatacagggagccaggca21

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cgacgacaagacccttggcatacaggctagagccaggcagttgttgttgttatggtctaa60

tttaaatatggtctaaagaagaagaattggcatacaggctagagccaggcaagggctctt120

ctcctc126

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cgacgacaagacccttggcatacaggctagagccaggcagttgttgttgttatgg55

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<400>9

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