一种桃叶珊瑚苷抑制炎症因子释放的应用的制作方法

本发明涉及桃叶珊瑚苷在抑制炎症因子释放的应用，桃叶珊瑚苷能抑制bv2细胞炎症从而控制神经炎症恶化，属于生物化学与分子生物学技术领域。

背景技术

桃叶珊瑚苷(au)是一种分子量仅为346.33的水溶性环烯醚萜类化合物，又名珊瑚木苷，化学名β-d-吡喃葡萄糖苷，分子式为c5h22o9，易溶于水，不溶于氯仿、乙醚、石油醚等。其广泛存在于车前科、杜仲科、马鞭草科、玄参科、山茱萸科等植物中。多年的研究发现，桃叶珊瑚苷是一种重要的生物活性物质,具有良好的抗炎、抗氧化、抗骨关节炎、护肝解毒、保肝护肝、抗肿瘤作用。它能促进干细胞再生，明显抑制乙型肝炎病毒dna的复制，其苷元及有效多聚体是一种抗菌素。近年来，桃叶珊瑚苷的抗炎作用越来越受到国内外研究人员的广泛关注。有研究发现，桃叶珊瑚苷可以显著抑制tnf-ɑ引发的致动脉粥样硬化脂肪因子，主要包括pal-1、il-6、mcp-1，其主要通过抑制炎性反应来实现的；桃叶珊瑚苷可以抑制erk的活化，从而抑制iκb在胞浆的降解，最终抑制核内的nf-κb激活，从而抑制炎症因子的转录及表达，桃叶珊瑚苷还可以抑制抗原诱导的iκb的降解和nf-κb的p65亚基的核异位；本课题组在前期研究中也发现，桃叶珊瑚苷可以减轻有神经炎症引起的帕金森病模型小鼠的病情。上述结果充分说明了桃叶珊瑚苷是一种潜在的可以通过抑制炎症反应而减轻慢性炎症疾病的中药提取物。

神经炎症主要是由脑内的胶质细胞激活引起的一种生理反应。胶质细胞主要包括小胶质细胞、星形胶质细胞等，其中小胶质细胞约占脑细胞总数的10％，胶质细胞总数的20％。小胶质细胞作为cns中主要的免疫效应细胞，在cns疾病中发挥重要作用。过度激活的小胶质细胞可以激活一些炎症因子的释放从而诱发细胞发生炎症反应。这其中包括tumornecrosisfactor-alpha(tnf-α),interleukin(il)-1β,interleukin(il)-6和诱导型一氧化氮合酶(inos)、谷氨酸盐(ghitamate)、一氧化氮(nitricoxide,no)、氧自由基(reactiveoxygenspecies,ros)等。

中医早在《黄帝内经》中就有关于神经退行性疾病的记载，并且中医治疗帕金森病的方法也很多。中药的药效缓和，长期服用对于慢性病的治疗更加适合。近年来，桃叶珊瑚苷抗炎活性更是得到深入研究，并且如其结构类似的梓醇已经被证实其具有抑制神经炎症的作用。本发明中应用到桃叶珊瑚苷作为一种天然药物成分它具有：毒副作用小；作用缓和持久；疗效稳定可靠等特点对其治疗小胶质细胞炎症进行了研究，并取得了一定成果。

技术实现要素：

本发明针对上述存在的问题，本发明的首要目的在于提供了一种潜在的治疗神经炎症疾病的药物——au。

本发明的技术方案：

一种桃叶珊瑚苷抑制炎症因子释放的应用，步骤如下：

(1)细胞培养：将bv2细胞放入37℃水浴锅中，融化后，将细胞吸出放入离心管中；在转速1000rpm/min离心5min，倒掉上清；将bv2细胞悬浮于含有体积分数为10％胎牛血清的无菌dmem培养液中，置于浓度为5％co2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养；细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次；

(2)药物配制：au用无菌pbs溶解至20mg/ml，保存温度为-20℃；lps用无菌dmem培养基溶解至10mg/ml，保存温度为-80℃；ifn-γ用无菌dmem培养基溶解制10⁵u/ml，保存温度为-80℃；

(3)药物处理正常细胞：传代培养后收集对数生长期的bv2细胞，加入含体积分数为10％胎牛血清的dmem培养基，稀释至5×10⁴-10⁵/ml，接种于每孔含有100μlbv2细胞对数生长期细胞悬液接种于96孔板中；设置5组实验组及2组对照组，每组6个复孔，第1组：无细胞的空白对照组；第2组：含有bv2细胞的对照组；第3组：5mg/lau；第4组：10mg/lau；第5组：50mg/lau；第6组：150mg/lau；第7组：200mg/lau；分别向各组中加入对应的药物，置于浓度为5％co2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育24小时，分别检测细胞活力记录数据并进行处理；

(4)药物处理炎症模型细胞：传代培养后收集对数生长期的bv2细胞，加入含体积分数为10％胎牛血清的dmem培养基，稀释至5×10⁴-10⁵/ml，接种于每孔含有100μlbv2细胞对数生长期细胞悬液接种于96孔板中；设置7组实验组及2组对照组，每组6个复孔，第1组：无细胞的空白对照组；第2组：含有bv2细胞的对照组；第3组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ组；第4组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+5mg/lau组；第5组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+10mg/lau组；第6组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+25mg/lau组；第7组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+50mg/lau组；第8组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+100mg/lau组；第9组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+200mg/lau组，其中lps、ifn-γ用于诱导bv2细胞产生炎症反应；分别向各组中加入对应的药物，置于浓度为5％co2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育24小时，分别检测细胞活力、活性氧、一氧化氮、il-1β、il-6和tnf-α水平，记录数据并进行处理。

本发明的有益效果：

1.本发明的数据建立在au对多种细胞系具有非常显著的抗炎、抗氧化作用。

2.本发明的数据以au的基本化学结构为理论依据，au是一种环烯醚萜类化合物，这类物质具有良好的抗炎效果，毒副作用小等特点，为研究其抗炎症作用提供了基础。

附图说明

图1为au对bv2细胞活力的影响的示意图。

图2为au对bv2炎症模型细胞活力的影响的示意图。

图3为au对bv2炎症模型细胞内活性氧水平的影响的示意图。

图4为au对bv2炎症模型细胞分泌出的一氧化氮水平的影响的示意图。

图5为au对bv2炎症模型细胞分泌tnf-α的影响的示意图。

图6为au对bv2炎症模型细胞分泌il-1β的影响的示意图。

图7为au对bv2炎症模型细胞分泌il-6的影响的示意图。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

本发明使用的细胞、试剂盒以及试剂：bv2细胞株，胎牛血清，双抗(青霉素/链霉素)，胰酶，pbs，dmem培养基，mtt试剂盒，ros试剂盒，一氧化氮试剂盒，tnf-αelisa试剂盒，il-1βelisa试剂盒，il-6elisa试剂盒，au，lps，ifn-γ。

实施例1

au对bv2细胞的毒性作用：将复苏的小胶质细胞bv2细胞培养于含有体积分数为10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液中，置于细胞培养瓶中，在37℃，5％co2及相对湿度90％的培养箱中培养，细胞长至70％-80％左右传代1次。待bv2细胞生长状态良好，用pbs洗去含有血清的培养基，用胰酶室温消化1分钟，加入含有体积分数为10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液终止消化，吹打并搜集细胞，1000rpm/min离心5min，用体积分数为10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液稀释至细胞密度为5×10⁴-10⁵/ml，每孔100μl接种于96孔板中，按照实验需求，分别向第1组：无细胞的空白对照组；第2组：含有bv2细胞的对照组；第3组：5mg/lau；第4组：10mg/lau；第5组：50mg/lau；第6组：150mg/lau；第7组：200mg/lau加入相应浓度的药物及培养基，各6个复孔，放入培养箱中孵育24小时。用mtt进行检测细胞活力，每孔加入20μl50mg/l的mtt，37℃孵育4小时，弃上清加入150μldmso振荡10分钟，使用酶标仪在490nm波长下检测od值记录并处理数据，计算细胞活性(cellviability)百分比。结果如图1所示，由图1可见，细胞活力随au浓度增加而减小，au浓度为200mg/l时细胞活力任然在90％以上，说明au对bv2细胞基本没有毒性。

实施例2

桃叶珊瑚苷au对bv2炎症模型细胞的细胞活力的影响：传代培养后搜集对数生长期bv2细胞，1000rpm/min离心5min，用体积分数为10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液稀释至细胞密度为5×10⁴-10⁵/ml，每孔100μl接种于96孔板中，按照实验需求，分别向第1组：无细胞的空白对照组；第2组：含有bv2细胞的对照组；第3组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ组；第4组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+5mg/lau组；第5组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+10mg/lau组；第6组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+25mg/lau组；第7组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+50mg/lau组；第8组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+100mg/lau组；第9组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+200mg/lau组加入相应浓度的药物及培养基，各6个复孔，放入培养箱中孵育24小时。用mtt进行检测细胞活力，每孔加入20μl50mg/l的mtt，37℃孵育4小时，弃上清加入150μldmso振荡10分钟，使用酶标仪在490nm波长下检测od值记录并处理数据，计算细胞活性(cellviability)百分比。结果如图2所示，由图2可见，模型组细胞活力与对照组相比有略微下降，加药各组对细胞活力没有明显上升。

实施例3

桃叶珊瑚苷au对bv2炎症模型细胞的细胞活力的影响：搜集对数生长期bv2细胞，1000rpm/min离心5min，用体积分数为10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液稀释至细胞密度为5×10⁴-10⁵/ml，每孔100μl接种于96孔板中，按照实验需求，分别向第1组：无细胞的空白对照组；第2组：含有bv2细胞的对照组；第3组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ组；第4组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+5mg/lau组；第5组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+10mg/lau组；第6组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+25mg/lau组；第7组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+50mg/lau组；第8组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+100mg/lau组；第9组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+200mg/lau组加入相应浓度的药物及培养基，各6个复孔，放入培养箱中孵育24小时。用no试剂盒进行检测，每孔取50μl细胞培养上清液，加入50μlgriessreagenti及50μlgriessreagentii，在540nm波长下检测吸光度。记录数据，根据标准曲线公式计算每孔no浓度。结果如图3所示，由图3可见，模型组细胞上清中no含量明显高于对照组，加药组细胞上清中no含量明显减少并与au浓度具有浓度依赖性关系。

实施例4

桃叶珊瑚苷au对bv2炎症模型细胞的细胞活力的影响：搜集对数生长期bv2细胞，1000rpm/min离心5min，用体积分数为10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液稀释至细胞密度为5×10⁴-10⁵/ml，每孔100μl接种于96孔板中，按照实验需求，分别向第1组：无细胞的空白对照组；第2组：含有bv2细胞的对照组；第3组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ组；第4组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+5mg/lau组；第5组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+10mg/lau组；第6组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+25mg/lau组；第7组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+50mg/lau组；第8组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+100mg/lau组；第9组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+200mg/lau组加入相应浓度的药物及培养基，各6个复孔，放入培养箱中孵育24小时。用ros试剂盒进行检测，每孔去上清，加入200μldmem洗去原培养液，加入200μldmem稀释的10μm的dcfh-da探针，37℃孵育20分钟，用dmem洗板3次洗去未结合的探针，用胰酶消化搜集细胞，在488nm激发波长，525nm发射波长下检测荧光强度。记录数据，根据处理数据，结果如图4所示。由图4可见，模型组细胞荧光强度明显高于对照组，加药组细胞荧光强度有所减少。

实施例5

au对bv2细胞的毒性作用：将复苏的小胶质细胞bv2细胞培养于含有体积分数为10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液中，置于细胞培养瓶中，在37℃，5％co2及相对湿度90％的培养箱中培养，细胞长至70％-80％左右传代1次。待bv2细胞生长状态良好，用pbs洗去含有血清的培养基，用胰酶室温消化1分钟，加入含有10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液终止消化，吹打并搜集细胞，1000rpm/min离心5min，用体积分数为10％fbs胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的无菌dmem培养液稀释至细胞密度为5×10⁴-10⁵/ml，每孔100μl接种于96孔板中，分别向第1组：无细胞的空白对照组；第2组：含有bv2细胞的对照组；第3组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ组；第4组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+5mg/lau组；第5组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+10mg/lau组；第6组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+25mg/lau组；第7组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+50mg/lau组；第8组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+100mg/lau组；第9组：0.1mg/llps+10⁴u/lifn-γ+200mg/lau组加入相应浓度的药物及培养基，各6个复孔，放入培养箱中孵育24小时。用elisa试剂盒检测细胞上清中il-1β、il-6、tnf-α的含量，取每孔上清50μl及50μl生物素抗原工作液于抱被好抗体的孔板中，37℃孵育1小时。弃上清，用pbst洗版5次后甩干，加入50μl亲和素-hrp，37℃孵育1小时。弃上清，用pbst洗版5次后甩干，加入50μl显色液a及50μl显色液b，37℃避光显色10分钟，加50μl终止液终止显色，在450nm波长下检测od值记录并处理数据。利用elisacalc软件拟合各细胞因子标准曲线并计算样品中细胞因子浓度。结果如图5、6、7所示，模型组细胞上清中il-1β、il-6、tnf-α浓度与对照组相比有明显上升，加药各组对细胞分泌细胞因子il-1β、il-6、tnf-α具有一定的抑制作用。