一种可用比率法检测过氧亚硝酸根的磷光聚合物探针及其制备与应用的制作方法

本发明属于有机光电功能材料技术领域，具体涉及一种水溶性的可用比率法检测过氧亚硝酸根的磷光聚合物探针及其制备与应用。

背景技术：

过氧亚硝酸根是一种短寿命的活性氮物质，细胞内的过氧亚硝酸根是由一氧化氮和超氧自由基快速反应形成的，其比一氧化氮或超氧自由基单独存在时更具有细胞毒性。正常水平的过氧亚硝酸根对于控制细胞的完整性是必不可少的。然而，越来越多的研究结果表明，浓度异常的过氧亚硝酸根可能导致许多人类疾病，包括缺血性再灌注损伤，类风湿性关节炎，感染性休克，多发性硬化症，中风，炎症性肠病和癌症等。由于过氧亚硝酸根寿命短，想要了解其介导过程变得较为困难。因此，研究一种可以精确检测过氧亚硝酸根的探针非常重要。

磷光过渡金属配合物，如铱配合物，是一类非常重要的光电材料，金属中心和配体之间的电荷转移和能量迁移展现出特殊的光电性能，具有高效的三线态磷光发射、较长的寿命、大的斯托克斯位移等优点，目前已经成为光电材料领域中的研究焦点，被广泛应用于生物成像和化学传感等领域。

目前，关于以铱配合物为检测位点，水溶性聚合物为基体材料的用于检测过氧亚硝酸根的生物探针的报道还较为少见，以水溶性聚合物作为基体材料可改善共聚物的水溶性和生物相容性，进而获得具有更多性能优异的聚合物光电材料，在光电领域，尤其是生物传感领域将可得到广泛的应用。且如果能够在特异性检测过氧亚硝酸根的铱配合物ir2的基础上，引入一种参比配合物ir1，与ir2形成参比，再与水溶性聚合物发生聚合反应，这样形成的共聚物不仅水溶性良好，在检测过氧亚硝酸根时还可以提高检测信噪比，更精准地检测过氧亚硝酸根。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种水溶性的可用比率法检测过氧亚硝酸根的磷光聚合物探针，并公开其制备方法和相关应用。该水溶性聚合物可应用于比率法精确地检测过氧亚硝酸根，在过氧亚硝酸根检测、细胞成像和活体成像等领域具有良好的应用前景。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明涉及一种可用比率法检测过氧亚硝酸根的磷光聚合物探针，其特征在于，其结构通式如下：

具有过氧亚硝酸根检测功能的磷光铱配合物ir2的合成路线如下：

其中，a为末端带双键的卤代烃；

其中，n2为整数；

其中，c2^n2配体为下列结构中的任一个：

能够用于比率法成像的水溶性磷光聚合物探针的合成路线如下：

其中，a、b、c为自然数，n1、n2为整数；

其中，ar为下列结构中的任意一种：

其中c1^n1配体为下列结构中的任一个：

具体合成步骤为：

(1)将1溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和叔丁基二苯基氯硅烷反应，室温下进行反应，过滤，旋去滤液中的有机溶剂，柱层析得到淡黄色油状液体2；

(2)将2、pd/c、水合肼在惰气保护下于乙醇溶液中进行回流反应，反应停止后趁热抽滤除去pd/c，旋去滤液中的有机溶剂，用乙醇重结晶，得到产物3；

(3)将3、4、醋酸铅、brettphos、cs2co3于惰性气体保护下在1,4-二氧六环溶液中进行反应，冷凝回流，抽滤除去盐，旋去滤液中的有机溶剂，得到产物5；

(4)将5和氢化钠于惰性气体保护下在dmf中冰浴反应一段时间后，加入a继续反应，随后加入饱和氯化铵水溶液进行淬灭，二氯甲烷萃取，浓缩有机相，柱层析得到辅助配体6；

(5)将6、铱二氯桥7在惰气保护下于二氯甲烷和甲醇的混合溶液中进行回流反应，降至室温，依次加入tbaf和kpf6反应，反应停止后过滤沉淀，旋去滤液中的有机溶剂，柱层析得到得到ir2；

(6)将ir1、ir2、偶氮二异丁腈(aibn)、ar于四氢呋喃中反应，循环进行冷冻-抽气-解冻操作数次，之后进行回流反应，乙醚沉降，抽滤得到聚合物p-onoo。

进一步地，所述磷光聚合物探针可用于比率法特异性检测水溶液中过氧亚硝酸根的变化。

进一步地，所述磷光聚合物探针可用于比率法特异性检测细胞内源性或外源性的过氧亚硝酸根。

进一步地，所述磷光聚合物探针可应用于荧光成像或时间分辨成像特异性检测水溶液中的过氧亚硝酸根。

进一步地，所述磷光聚合物探针可应用于荧光成像或时间分辨成像特异性检测细胞内源性或外源性的过氧亚硝酸根。

进一步地，所述磷光聚合物探针可应用于细胞成像传感领域。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的磷光聚合物探针是由两种磷光铱配合物(ir1、ir2)和水溶性聚合物共聚而成，其中，磷光铱配合物ir1作为惰性的磷光内参单元，对过氧亚硝酸根不响应；磷光铱配合物ir2作为磷光响应单元，能够与过氧亚硝酸根发生化学反应，实现对过氧亚硝酸根的特异性响应水溶性聚合物作为聚合物的主链构成单元，赋予聚合物良好的水溶性和生物相容性。

2.本发明提供的磷光聚合物探针能够精准检测过氧亚硝酸根浓度的变化，结合比率法排除背景荧光信号的干扰，提高检测信噪比；

3.本发明提供的磷光聚合物探针具有良好的水溶性和生物相容性，可以实现对细胞内源性/外源性的过氧亚硝酸根检测；

4.本发明提供的磷光聚合物探针的生物毒性小，对生物样品的损伤小，可以实现对活体领域过氧亚硝酸根变化的检测，

5.本发明公开的磷光聚合物探针在生物成像与传感方面具有重要的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例3中铱配合物ir1分别在有、无过氧亚硝酸根条件下的发射光谱；

图2是本发明实施例3中铱配合物ir2分别在有、无过氧亚硝酸根条件下的发射光谱；

图3是本发明实施例4中水溶性聚合物探针p-onoo的滴定发射光谱；

图4是本发明实施例5中水溶性聚合物探针p-onoo的滴定发射光谱中两个发射峰比值(i680/i605)的大小随过氧亚硝酸根浓度变化的图谱；

图5是本发明实施例6中水溶性聚合物探针p-onoo的离子选择性实验图谱；

图6是本发明实施例7中水溶性磷光聚合物探针p-onoo的细胞共聚焦成像实验结果图。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

实施例1：能够检测过氧亚硝酸根的磷光铱配合物ir2的制备

具体的操作步骤为：

化合物2的制备：将1(3.0mmol)加入圆底烧瓶中，抽真空换氮气三次以排除空气中的水；随后，向烧瓶中依次注入干燥的二氯甲烷、三乙胺(0.5ml)和叔丁基二苯基氯硅烷(4.5mmol)，在室温下搅拌6小时；反应结束后，过滤掉白色沉淀，取滤液旋去有机溶剂，柱层析得到淡黄色油状液体2，产率80％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):7.78(dd,j＝8.0hz,2.4hz,4h),7.72(d,j＝2.8hz,1h),7.66(dd,j＝8.8hz,2.8hz,1h),7.47-7.40(m,6h),6.80(d,j＝8.8hz,1h),3.68(s,3h),1.22(s,9h).δ(ppm):¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):151.3,150.6,142.1,135.3,132.4,130.2,127.9,119.5,117.3,107.3,55.6,26.6,19.9.

化合物3的制备：将2(2.4mmol)、pd/c(100mg)加入双口烧瓶中，并用锡箔纸包裹烧瓶避光，抽真空换氮气三次以排除氧气；依次向烧瓶中注入乙醇(10ml)和水合肼一水合物(0.5ml)，在70℃下搅拌回流反应6小时；反应停止后，趁热抽滤除去pd/c，滤液旋去有机溶剂，用乙醇重结晶两次，得到3，产率93％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.75-7.72(m,4h),7.42-7.33(m,6h),6.54(d,j＝8.8hz,1h),6.18(d,j＝2.8hz,1h),6.00(dd,j＝8.0hz,2.8hz,1h),3.54(s,3h),1.12(s,9h).

化合物5的制备：将3(2.3mmol)、4(2.3mmol)、醋酸铅、brettphos(0.115mmol)、cs2co3(1.2mmol)加入到烧瓶中，抽真空除氧，在氮气保护氛围下注入干燥的1,4-二氧六环；升温至110℃冷凝回流16小时，抽滤除去盐，取滤液旋去有机溶剂，柱层析得到5，产率21％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):8.61(d,j＝4.0hz,1h),8.32(d,j＝8.0hz,1h),8.28(d,j＝6.0hz,1h),7.80(d,j＝2.4hz,1h),7.77-7.72(m,5h),7.43-7.34(m,6h),7.24(ddd,j＝7.6hz,4.8hz,1.2hz,1h),6.71(d,j＝8.4hz,1h),6.65(dd,j＝5.6hz,2.4hz,1h),6.61(d,j＝2.4hz,1h),6.51(dd,j＝2.8hz,1h),6.33(s,1h),3.51(s.3h),1.15(s,9h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):156.8,156.4,152.7,151.1,149.9,149.0,142.3,136.9,135.5,133.5,133.3,129.7,127.6,123.6,121.2,120.6,115.4,108.4,108.3,106.8,55.4,26.7,19.8.

化合物6的制备：将5(0.5mmol)和氢化钠(0.5mmol)加入到烧瓶中，抽真空除氧，氮气氛围下注入干燥的dmf(5ml)；冰浴条件下搅拌20分钟；注入烯丙基溴(0.5mmol)，室温下继续反应2小时；用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次，取有机相浓缩，柱层析得到6，产率87％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):8.63(ddd,j＝4.8hz,1.6hz,0.8hz,1h),8.32(d,j＝8.0hz,1h),8.24(d,j＝6.0hz,1h),7.77-7.72(m,5h),7.70(d,j＝2.8hz,1h),7.44-7.35(m,6h),7.21(ddd,j＝7.6hz,4.8hz,1.2hz,1h),6.81(d,j＝8.4hz,1h),6.63(d,j＝2.4hz,1h),6.08(dd,j＝8.4hz,2.4hz,1h),6.39(dd,j＝6.0hz,2.8hz,1h),5.97-5.87(m,1h),5.24(dd,j＝17.2hz,1.2hz,1h),5.19(dd,j＝10.4hz,1.2hz,1h),4.31(d,j＝4.8hz,2h),3.50(s,3h),1.18(s,9h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):156.9,156.5,154.5,151.5,149.2,149.0,143.9,138.9,136.7,135.5,133.4,132.8,129.8,127.6,123.3,121.2,121.1,119.6,117.2,111.7,108.7,105.3,55.4,54.6,26.7,19.8.

配合物ir2的制备：将6(0.4mmol)、铱二氯桥7(0.2mmol)加入烧瓶中，抽真空除氧，在氮气保护氛围下注入二氯甲烷和甲醇12ml(v/v＝2/1)；50℃搅拌回流6小时后，降至室温，加入tbaf·3h2o(0.3mmol)继续搅拌4小时。随后，加入过量的kpf6(0.3mmol)继续反应4小时。反应停止后，过滤沉淀，取滤液旋去有机溶剂，柱层析得到ir2，产率95％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):9.05(d,j＝7.6hz,2h),8.03(t,j＝7.2hz,1h),7.94-7.91(m,2h),7.85-7.75(m,8h),7.64-7.62(m,1h),7.42(d,j＝6.4hz,1h),7.28-7.24(m,4h),7.17(d,j＝8.0hz,1h),7.12(d,j＝8.0hz,1h),6.89(d,j＝4.8hz,1h),6.82(s,1h),6.72-6.64(m,3h),6.32(s,1h),6.13(dd,j＝3.2hz,8.0hz,2h),5.96-5.87(m,1h),5.30(d,j＝4.0hz,1h),5.24(d,j＝10.8hz,1h),4.41(t,j＝15.6hz,2h),3.86(s,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):165.7,165.5,157.3,156.9,156.6,155.4,154.7,150.3,149.0,148.0,145.6,144.7,144.4,143.9,143.7,141.8,141.6,139.9,137.2,137.0,136.0,135.5,135.3,132.2,131.5,128.7,128.6,128.0,127.8,127.6,127.1,127.0,126.9,126.5,126.4,126.2,126.1,125.1,125.0,124.6,124.5,124.4,122.3,122.2,120.2,120.1,120.0,119.6,118.0,115.2,110.3,108.0,56.4,55.5.

实施例2：对过氧亚硝酸盐敏感的配合物水溶性聚合物探针p-onoo的制备

其中，a、b、c为自然数；

具体操作步骤为：向schlenk反应管内加入ir1(0.03mmol)、ir2(0.3mmol)、aibn(0.3mmol)、吡咯烷酮(10.0mmol)和少量四氢呋喃(5ml)；冷冻-抽气-解冻，如此循环三次，升温至70℃搅拌回流6小时；反应停止后，用乙醚沉降三次，抽滤得到p，产率32％。

实施例3：配合物ir1、ir2对过氧亚硝酸根响应性发射光谱测试

本发明采用的铱配合物ir1、ir2光谱测试浓度为10μm，测试溶剂为混有1％dmso的pbs溶液，测发射光谱时，激发波长为605nm。

铱配合物ir1在有、无过氧亚硝酸根条件下的发射光谱结果如图1所示，从图中可以看出配合物ir1在有、无过氧亚硝酸根存在的情况下，其发射波长均为605nm，发光强度随着过氧亚硝酸根浓度的改变几乎未变，结果表明，铱配合物ir1可以作为参比应用于过氧亚硝酸根的检测中，与ir2构建比率法，可减少环境中不必要的干扰，增加了检测的准确性。

铱配合物ir2在有、无过氧亚硝酸根条件下的发射光谱结果如图2所示，从图中可以看出配合物ir2在有、无过氧亚硝酸根存在的情况下，其发射波长均为680nm，且发光强度随着过氧亚硝酸根浓度的增加而增强，结果表明根据发光强度，ir2可应用于过氧亚硝酸根的特异性检测。

实施例4：聚合物p-onoo对过氧亚硝酸根响应性发射光谱测试

聚合物探针p-onoo的滴定发射光谱结果如图3所示，从图中可以看出p-onoo同时呈现出ir1和ir2的发射峰，随着过氧亚硝酸根含量的增加，ir1发射峰的位置和强度几乎没有变化，而ir2发射峰的强度却逐渐增高，结果表明p-onoo对过氧亚硝酸根非常敏感，可以应用于对过氧亚硝酸根的特异性检测。

实施例5：聚合物p-onoo的滴定发射光谱

聚合物探针p-onoo的滴定发射光谱中两个发射峰比值(i680/i605)的大小随过氧亚硝酸根浓度变化的结果图谱如图4所示，聚合物p-onoo的测试浓度为0.1mg/ml，从图中可以看出，随着过氧亚硝酸根浓度的增加，i680/i605呈现出有规律的增加，结果表明通过比率法，聚合物p-onoo可以实现对过氧亚硝酸根的特异性检测。

实施例6：水溶性聚合物探针p-onoo的离子选择性实验

聚合物探针p-onoo的离子选择性实验结果图谱如图5所示，将探针p-onoo分别与过氧亚硝酸根和活性氧氮物种及阴阳离子反应，过氧亚硝酸根的i680/i605值明显增大，而其他干扰性物质的i680/i605值无明显变化；结果表明，探针p-onoo对于过氧亚硝酸根具有很好的特异性响应，可以用于对过氧亚硝酸根的特异性检测。

实施例7：聚合物p-onoo的细胞共聚焦成像实验

聚合物p-onoo探针用于活细胞内过氧亚硝酸根检测的共聚焦成像实验(如图6所示)。具体实施过程为：

(1)对照组中，用含有聚合物探针p-onoo(0.1mg/ml)的dmem培养液培养raw264.7巨噬细胞，在37℃条件下含有5％co2的空气中孵育2小时，pbs缓冲溶液洗涤后用于成像实验；

(2)实验组1中，用含有聚合物探针p-onoo(0.1mg/ml)的dmem培养液培养raw264.7巨噬细胞，在37℃条件下含有5％co2的空气中孵育2小时后，再加入过氧亚硝酸根释放剂sin-1(100μm)，继续培养2小时，pbs缓冲溶液洗涤后用于成像实验；

(3)实验组2中，用含有聚合物探针p-onoo(0.1mg/ml)的dmem培养液培养raw264.7巨噬细胞，在37℃条件下含有5％co2的空气中孵育2小时后，再依次加入过氧亚硝酸根清除剂fetmpyp(50μm)、过氧亚硝酸根释放剂sin-1(100μm)，继续培养2小时，pbs缓冲溶液洗涤后用于成像实验；

(4)实验组3中，用含有聚合物探针p-onoo(0.1mg/ml)的dmem培养液培养raw264.7巨噬细胞，在37℃条件下含有5％co2的空气中孵育2小时后，再加入naclo(100μm)，继续培养2小时，pbs缓冲溶液洗涤后用于成像实验；

(5)实验组4中，用含有聚合物探针p-onoo(0.1mg/ml)的dmem培养液培养raw264.7巨噬细胞，在37℃条件下含有5％co2的空气中孵育2小时后，再加入h2o2(100μm)，继续培养2小时，pbs缓冲溶液洗涤后用于成像实验。

从图6的细胞成像图片可以看出，实验组2、实验组3、实验组4中的绿光(伪彩色)通道、红光通道的亮度以及比率成像通道中的比值(红光/绿光)与对照组中的相应通道相比，基本保持一致；而实验1组中，绿光通道的亮度保持不变，红光通道亮度提升，比率成像通道中的比值增大；这些结果表明，借助共聚焦激光扫描显微镜，聚合物探针p-onoo可以用于特异性检测活细胞内的过氧亚硝酸根。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。