可覆盖多亚型的HIV-1总DNA定量检测引物对、探针及检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种hiv-1总dna定量检测引物对、探针及检测试剂盒，具体地说是一种可覆盖多亚型的高灵敏度和特异性的hiv-1总dna定量检测引物对、探针及检测试剂盒。

背景技术

截至2018年5月底,我国报告现存活艾滋病病毒感染者/aids病人81万,报告死亡25万，尚有三成感染者未意识到感染而未被发现，疫情不容乐观。因此，尽早发现hiv感染者，及早治疗，降低感染者病毒载量，从源头上控制传染源，是当前艾滋病感染防控的一个重要战略措施。

hiv感染后，最先出现的病毒标志物是病毒核酸和抗原。hiv病毒进入人体后首先感染cd4细胞，在细胞内，病毒rna发生逆转录并整合于人的基因组中，形成hiv的病毒储藏库。因此，hivdna是最先能被检测到的病原学指标。其后约在感染后11天，才可以检测到hiv病毒核酸；之后是p24抗原，最后才出现抗hiv的抗体。因此hiv病毒dna是感染之后最早能查到的病毒标志物，hivdna核酸检测能极大的缩短hiv感染检测的“窗口期”。此外，由于hiv阳性母亲的抗体存在于新生婴儿体内，对于18个月龄以下的新生儿hiv感染的诊断，也必须依赖于hiv核酸检测。

治疗方面，国家制定的“四免一关怀”政策使得我国绝大多数感染者能得到有效的抗病毒治疗，hiv感染者延长了生命、提高了生活质量。而今，更为前沿的“早发现、早治疗”、“发现即治疗”治疗策略有效地抑制了病毒复制，降低了感染者的病毒储藏库，为今后针对感染者制定个体化治疗方案甚至功能性治愈提供了可能。而与此同时，仅依赖外周血hivrna载量和cd4+t淋巴细胞计数已经不能满足当前cart疗效的评价，hiv储藏库定量技术则正在从过去的科研需求而转变为目前临床治疗的需求。

传统的基于病毒培养试验的hiv储藏库定量技术(qvoa,quantitativeviraloutgrowthassay，又名iupm,infectiousunitspermillion)操作复杂，对技术人员、实验设备和实验室环境等要求非常高，因为涉及到静息型cd4t淋巴细胞的纯化，所以需要采集患者血液量巨大(120ml-180ml)，应用到临床检测的困难不言而喻。有报道这种方法重复性较差，在检测具有微小差异的hiv储藏库时并不可靠的。如用该方法对“密西西比小孩”的检测，在病毒抑制期，结果都是阴性的，而hivdna则呈阳性反应(阳性反应，<4拷贝/10⁶细胞),随后在cart停止后27.6个月时，病毒出现了反弹。此外，细胞内hivrna定量检测也被认为是另一种可以评估cart治疗中的残留的、有转录活性的感染细胞，可以间接地反映hiv储藏库的活性，但目前该方法也仅处于实验室研究阶段，尚需评估大规模临床应用的可能性。近年来，数字pcr(digitaldropletpcr，ddpcr)技术也被用来进行hivdna的定量实验，但该方法需要的仪器设备昂贵，技术操作复杂，以及假阳性的结果出现也是该方法用于临床诊断中存在的主要问题。

与其他方法相比，基于real-timepcr的hiv总dna检测方法具有灵敏度高、操作简便、高通量、重复性强且价格低廉的优势。总hivdna(1-ltr、2-ltr和线性hivdna)载量作为hiv储藏库的重要标志物，具有重要的临床意义；其是最简单、最敏感、最易重复和标准化的艾滋病毒储藏库测定方法，并可作为一项常规的临床检验项目而开展。

hiv-1病毒隶属于逆转录病毒科，其独特的复制特点导致hiv基因变异度大，基因亚型众多，新的重组流行毒株日益增多。近年来，随着全球经济一体化的步伐加快，许多境外传入hiv亚型毒株不断在我国被发现；此外，一些性行为活跃的hiv感染者或高危人群的无保护性行为也为新的hiv重组株的出现提供了适宜的土壤。早在全国第三次hiv分子流行病学调查时就已发现我国当时至少存在10种流行亚型和重组亚型毒株，包括a，b，b’，c和g亚型毒株以及crf01_ae、crf02_ag、crf06_cpx、crf07_bc和crf08_bc重组株。之后，不断有新的重组毒株被发现并已形成小规模流行，如crf55_01b和crf59_01b是继crf07_bc和crf08_bc以来我国鉴定的最重要的新的hiv重组毒株；随后，又相继发现了crf57_bc、crf61_bc、crf62_bc、crf64_bc、crf65_cpx重组毒株。日益增多的hiv基因亚型毒株和日趋复杂的病毒流行特征，对我国以核酸技术为主的诊断试剂的研发和应用都带来了巨大的挑战。

现有商用hivdna检测试剂盒虽然可以实现简单快速高灵敏度的检测hiv-1，但现有试剂盒对hiv-1的亚型覆盖并不理想，最多也仅能覆盖9个亚型。但是hiv检测亚型覆盖全面与否对早诊断早治疗具有重要的意义，可尽可能降低hiv早期感染的漏检率。现有检测试剂盒为了实现对多亚型的覆盖，采用的技术手段一般为使用多个引物组和多个探针进行不同hiv亚型检测，最少也至少包括三个引物组，每个引物组包括至少三个引物对，即上下游引物至少六条，以及针对不同引物组的探针若干。由于扩增引物对繁多，其最大的技术问题是操作繁冗、成本高昂、扩增污染及不准确等实际应用问题，且缺乏基因亚型覆盖面的临床数据。此外，我国hiv基因亚型的日益多样化，也为单一试剂盒的检测效能带来了很多不确定性。

出于对我国目前艾滋病防治的实际需求和经济考量，我们认为开发一种高通量、低成本、亚型覆盖面广泛的hivdna载量检测试剂盒，是当前艾滋病防治亟待解决的问题。基于此，我们开发了多亚型覆盖的单一引物组的hivdna定量检测试剂盒，其不仅可用于急性期hiv感染的诊断、新生儿hiv感染的诊断，并可为今后艾滋病的个体化精准治疗、探索功能性治愈提供有力的技术支持，作为除hivrna载量和cd4t淋巴细胞计数之外的又一个cart疗效评价的预测指标。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种可覆盖多亚型的hiv-1定量检测引物对和探针。

本发明的第二目的在于提供一种含有上述引物对和探针的检测试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种可覆盖多亚型的hiv-1总dna定量检测引物对和探针，其中，所述引物对的上游引物hiv-u1序列如seqidno.1所示；下游引物hiv-r1序列如seqidno.2所示；所述探针probe-hiv序列如seqidno.3所示。

上述的hiv-1总dna定量检测引物对和探针在制备定量检测多亚型hiv-1检测试剂盒中的用途。

一种可覆盖多亚型的hiv-1总dna定量检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述的引物对和探针。

在本发明所述试剂盒中，上述上游引物hiv-u1和下游引物hiv-r1终浓度各0.4μmol/l；上述探针probe-hiv终浓度为0.1μmol/l。

上述试剂盒还包括针对内参基因cd3的内参引物对和内参探针；所述内参引物对的上游引物cd3-u1序列如seqidno.4所示；所述内参引物对的下游引物cd3-r1序列如seqidno.5所示；所述内参探针probe-cd3序列如seqidno.6所示。

在本发明所述试剂盒中，上述内参引物对的上游引物cd3-u1和下游引物cd3-r1的终浓度各0.4μmol/l；所述内参探针probe-cd3终浓度为0.1μmol/l。

本发明所述试剂盒还包括pcr反应液。具体pcr反应体系为：1×pcr缓冲液，taq热启动聚合酶1u，含du的dntp终浓度0.2μmol/l，ung酶1u，上游引物hiv-u1和下游引物hiv-r1终浓度各0.4μmol/l，探针probe-hiv终浓度为0.1μmol/l，内参引物对的上游引物cd3-u1和下游引物cd3-r1的终浓度各0.4μmol/l，所述内参探针probe-cd3终浓度0.1μmol/l，模板dna量5μl(总量50ng-1μg)，余者各用纯净水补至25μl。

本发明试剂盒pcr反应条件为：25℃10分钟，95℃，2分钟；94℃，15秒；60℃，30秒；45个循环，将荧光吸收反应设置在60℃，30秒时间段内；每次反应设hiv阴性对照、低载量阳性对照及空白水对照。

本发明试剂盒覆盖的hiv-1亚型为hiv-1m组a、b、c、d、f、g、h、j和k9个基因亚型；以及中国常见hiv-1重组亚型crf01_ae、crf07_bc和crf02_ag；以及o组、n组亚型ltr基因保守区域。

本发明的有益效果：

(1)本发明的hiv-1总dna定量检测技术所用的hiv靶基因引物和探针均位于hiv基因组更为保守的ltr基因区域，在与国际hiv数据库搜索比对后发现，引物、探针序列与国际数据库所公布的hiv流行亚型序列均高度保守，平均97％以上的序列与数据库序列只存在低于一个碱基的变异。引物的高度保守适宜于我国日益复杂的hiv流行态势，且实际验证该引物和探针能成功检测12种基因亚型以及重组亚型毒株，包括目前我国的主要hiv流行亚型crf01_ae、crf07_bc、b亚型毒株以及其他较为少见的hiv流行亚型毒株。能成功检测12种常见亚型及稀有hiv亚型，较目前其他商业检测试剂盒具有更宽泛的亚型检测覆盖面。

(2)更重要的是本发明引物设计中采用简并引物，反应中hiv靶基因扩增仅需使用一对特异性引物和一条特异性探针即可实现高灵敏度和特异性的检测，克服了同类检测试剂盒扩增引物及探针众多而导致的操作繁冗和成本增加等问题。

(3)本发明试剂盒扩增灵敏度可达4个拷贝/pcr反应管，灵敏度试验也显示该技术具有检测极低拷贝hivdna的能力，几乎达到了pcr检测的极限；此外，本发明检测方法加入了细胞定量体系，做到了在同一个pcr反应管中既定量了hivdna又定量了细胞数；批内和批间差异性的变异系数均在20％以内，显示了该技术在实际检测临床样本中良好稳定性和重复性；特异度检测显示，本发明检测方法对其他病原标本均为阴性反应，特异度为100％。临床样本对59份hiv抗体阳性的感染者进行检测，结果显示：35份血浆rna病毒载量低于检测限(tnd)的样本，其中34份(97％)dna载量为阳性结果；24份血浆rna载量阳性样本，dna载量阳性率为100％。本发明可用于hiv病毒储藏库检测，可用于监测大型队列中hiv感染个体的持续性感染状况，评估cart治疗效果，可以用于“窗口期”hiv感染的辅助诊断以及hiv阳性母亲的新生儿hiv感染的诊断。该方法操作简单，成本低，易于操作，易于推广应用。

(4)本检测技术使用一管双重pcr技术，可做到在同一个pcr反应管内既能定量检测hiv靶基因，又能定量内参基因，做到了细胞数和靶基因的同步定量，从而可以计算出单位细胞内包含hiv靶基因量，相比其他需要将内参基因和靶基因分开检测的试剂，本检测技术操作简便，大大节约了时间成本和耗材、试剂成本。

(5)标准品的设计是本发明的重要发明点：将hivltr基因与cd3内参基因克隆到同一个载体内，避免了使用不同的标准品体系引发的系统误差。hiv靶基因和内参cd3基因的pcr扩增长度只相差6个碱基，从而保证了一管双重pcr反应扩增效率的一致性，加入的cd3内参基因定量将hiv拷贝数与细胞数有效关联，从而可以精确定量到以细胞数为单位的hivdna拷贝数。

附图说明

图1为hiv-1和cd3扩增线性范围图；

图2为本发明特异度扩增图谱；

注：红色为内参基因扩增曲线，绿色为hiv靶基因扩增曲线；

图3为7份hivdna阳性样本的批内重复差异性分析扩增图谱；

注：左上图为全部样本扩增图谱，编号1-7为7份不同样本单个样本重复性扩增图谱；

图4为56份临床样本gag基因区域系统进化树图；

注：该进化树所有参考株序列均来自hiv序列数据库(https://www.hiv.lanl.gov/)；

临床样本编号为：bj01～bj56；

图5为hivdna载量分布图

a：hivrna病毒载量及其对应的dna载量结果图；

b：血浆rna载量阳性组与血浆rna载量阴性组所对应的hivdna载量。

vir：血浆rna阳性组，tnd：血浆rna低于试剂盒最低检测下限组。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1本发明检测试剂盒的构建

(1)hivdna定量标准品的构建

通过t-a克隆将hiv基因和部分cd3内参基因分别连接到克隆载体上，通过酶切、连接反应将两个基因串联到同一个质粒载体上，构建同时包含hiv靶基因和内参基因的标准品。

具体实施方案如下：将hivltr基因554bp(nt356～nt890，hxb2)的扩增片段以及人cd3基因812bp(nt460～nt1251，nc_000011.10)的扩增片段通过分子克隆技术同时连接到同一个pmd20-tvector载体(takara，codeno.6028)上，用pcr和酶切、连接的方法鉴定同时含有两个目的基因片段的阳性质粒。提取质粒并测定其浓度，根据以下公式计算质粒拷贝数：6.02×10²³×(ng/μl×10^-9)/(dnalength×660)＝copies/μl。上述标准品质粒按照10倍浓度梯度稀释，选择一定浓度范围内质粒作为扩增体系的标准品。

(2)特异性引物、探针设计

从国际hiv序列数据库(https://www.hiv.lanl.gov)下载hiv-1亚型标准株序列，用bioedit生物软件进行序列比对，选择hiv-1ltr基因保守区，用oligo6.0软件设计特异性引物和taqman探针。定量细胞数的内参基因为cd3基因，已证实人类每个细胞内均含有两个cd3基因拷贝。人cd3基因组全序列从https://www.ncbi.nlm.nih.gov网站下载。hiv-1taqman水解探针5’端用fam荧光基团标记，3’端用tamra基团标记；cd3taqman探针5’端用cy5标记，3’端用bhq-3标记。具体引物及探针序列见表1所示。

表1实时荧光定量pcr引物和探针序列

备注：y＝c/t,人cd3参考基因nc_000011.10，hiv参考基因为hxb2-lai-iiib-bru.b(k03455)

(3)样本处理及pcr扩增系统、条件设置

a)样本处理

静脉采集人edta抗凝全血标本(wholebloodcell,wbc)或外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)，用qiagen全血dna提取试剂盒提取dna(提取方法依照试剂盒说明书)，dna溶于200μlte缓冲液中，-20℃冻存备用。

b)real-timepcr扩增

hiv靶基因和内参基因扩增体系配置：1×pcrbuffer，taqhs热启动taqase(takara)1u，含du的dntp终浓度0.2μmol/l(dutp浓度为0.6μmol/l)，ung1u，hiv引物(hiv-u1，hiv-r1)终浓度各0.4μmol/l，hiv靶探针(probe-hiv)终浓度为0.1μmol/l；cd3靶基因相应的引物为cd3-u1，cd3-r1终浓度各0.4μmol/l，cd3靶探针(probe-cd3)终浓度0.1μmol/l。模板dna量5μl(50ng-1μg)，余者各用纯净水补至25μl。反应条件为25℃10分钟(ung处理)，95℃，2分钟(ung失活)；94℃，15秒；60℃，30秒；45个循环(real-timepcr扩增)，将荧光吸收反应设置在60℃，30秒时间段内。每次反应设hiv阴性对照、低载量阳性对照及空白水对照。

c)总hiv-1dna定量计算公式

hivdna拷贝数和细胞数分别由含hiv靶基因的标准品确定，单位细胞数(pbmc或全血细胞wbc)所含hivdna拷贝数计算公式为：

hivdna拷贝数/细胞数＝hiv拷贝数/2*cd3拷贝数。

d)结果有效性判定

同一批次实验结果中，hiv阴性对照dna样本靶基因扩增阴性，而内参基因cd3扩增阳性；hiv低载量阳性样本靶基因和cd3基因扩增均为阳性且空白水对照二者扩增均为阴性，同时满足上述条件确定为本次结果有效。

(4)灵敏度和线性范围的确定方法

梯度稀释同时含hiv靶基因和内参基因的质粒标准品，用上述扩增方法扩增后，分别确定靶基因和内参基因标准品的线性扩增范围；梯度稀释含hiv和cd3基因的质粒标准品进行扩增，确定针对上hiv靶基因扩增的灵敏度指标；

(5)特异度分析方法

选择40例hiv阴性和健康人标本，其中hiv阴性标本包含hbv,hcv，庚型肝炎病毒标本所提取的核酸dna进行引物和探针扩增特异度分析。

(6)批间和批内差异性分析方法

随机选择7份hiv阳性的临床样本，从pbmc分离、dna提取、pcr扩增进行该方法的批间差异分析，由同一个技术人员分别在3个不同的工作日内检测完毕。批内差异检测选择另外7份hiv阳性的临床样本，同一份样本在同一批次重复检测3次，后进行批内差异性分析。

(7)不同基因亚型的临床样本检测方法

该dna定量检测试剂盒检测临床样本dna56份，进行gag区基因扩增、测序，确定hiv毒株基因型。用bioedit生物学软件进行序列比对，用mega5.0的neighbor-joiningtree进行系统进化树构建。

本发明实验结果及分析

1.本发明引物和探针亚型覆盖面分析

为了设计出针对我国hiv-1流行病毒亚型的特异性引物和探针序列，我们在hiv数据库里下载了包括hiv-1m组9个基因亚型(a、b、c、d、f、g、h、j、k)以及中国常见hiv-1重组亚型(crf01_ae、crf07_bc、crf02_ag)和o组、n组亚型ltr基因保守区域。设计出了相应的引物和探针序列，如上述表1所示。将所设计的引物和探针序列输入到hiv数据库(https://www.hiv.lanl.gov)与上述亚型的所有毒株序列进行比对。共2601条hiv-1毒株ltr序列与引物hiv-u1进行了保守性比对，发现97％的毒株序列与引物hiv-u1无错配或仅有1个碱基的错配；共用3226条hivltr区毒株序列与引物hiv-r1进行了保守性比对，发现99％的毒株序列与引物hiv-r1序列无错配或仅有1个碱基错配；共1502条毒株序列与hiv-1探针序列进行了保守性比对，发现98.5％的毒株序列与探针的无错配或仅有一个碱基错配。说明，本发明引物对hiv-1m组、n组和o组病毒株以及流行重组株都有良好的匹配性。具体结果见表2所示。

表2引物和探针与hiv各亚型毒株匹配百分率

2.hivdna靶基因和内参基因定量标准品线性范围和灵敏度

按10倍梯度稀释同时含hiv靶基因和内参基因的质粒标准品，分别获得4×10⁶～4拷贝质粒梯度。实时荧光定量pcr扩增后，发现hiv-1靶基因在4×10⁶～4拷贝梯度呈线性扩增；cd3靶基因在4×10⁶～40拷贝范围呈线性扩增。hiv-1靶基因灵敏度可达4拷贝/pcr反应管。hiv靶基因和cd3内参基因扩增效率均大于95％(分别为97.83和98.32)，相关系数r均大于0.98(分别为0.999和1)，具体结果见图1。

3.hiv靶基因引物特异度分析

40例hiv阴性和健康人标本，分离外周血单个核细胞后，提取基因组dna。用该试剂盒检测特异性检测。结果，不论是健康人标本还是其他病原体标本dna，hiv靶基因检测结果均为阴性，特异度达100％，具体结果见图2所示。

4.批间差异性分析

7份dna样本的批间差异结果显示，dna载量分布在6.90×10¹～8.99×10³copies/10⁶pbmc之间；变异系数位于10～18％之间。具体如表3所示。

表3批间检测差异结果

5.批内差异性分析

批内差异性结果分析显示，7份样本的载量分布在1.23×10³～1.42×10⁴copies/10⁶pbmc临床样本，批内检测差异的变异系数位于13～18％之间。见表4和图3所示。

表4批内检测差异结果

6.亚型覆盖面检测

利用gag区(p17～p24)基因测序确定hiv基因亚型的临床标本56份，用本发明定量试剂盒检测，结果56份临床标本dna检测结果均为阳性。序列测定结果显示，该56份阳性样本共包含12个hiv基因亚型及重组亚型。其中m组基因亚型包括a亚型(1份，2％)，b亚型(3份，5％)，b’亚型(2份，4％)，c亚型(1份，2％)；重组亚型包括crf01_ae(22份，39％)，crf02_ag(1份，2％)，crf07_bc(15份，27％)，crf08_bc(1份，2％)，crf55_01b(2份，4％)，crf65_cpx(2份，4％)，crf67_01b(5份，9％)，以及二代重组型样本crf01_ae/07_bc(1份，2％)。表明该dna检测试剂不仅能检测到我国常见的流行基因亚型(crf01_ae、crf07_bc,b，b’等)，也能检测到较为少见的其他流行亚型或重组亚型甚至二代重组亚型；该hiv-1dna检测试剂至少能够检测12个基因型和重组亚型。序列进化树见图4。

6.临床样本检测

收集hiv阳性临床样本59份，其中35份样本血浆rna病毒载量低于检测限(tnd)，24份样本血浆rna载量阳性,进行dna载量测定。结果显示，24份血浆rna载量阳性样本，dna载量均为阳性(24/24，100％)；rna载量中位数为4.07(1.7～5.51)logcopies/ml，其对应dna载量中位数为2.59(1.47～3.84)logcopies/10⁶pbmc；35份血浆rna病毒载量低于检测限(tnd)的样本，其中34份(97％)dna载量为阳性结果，log10中位数为2.08(0～3.18)log

copies/10⁶pbmc。血浆hivrna阳性组样本对应的hivdna载量显著高于血浆hivrna阴性组样本对应的hivdna载量，p＝0.009。见图5a和图5b所示，一份样本的dna检测呈阴性反应。回顾病历资料显示，该名患者接受cart治疗超过5年，血浆rna载量一直低于检测限。根据文献报道，此类患者体内病毒含量极低，其体内每一百万个静止型cd4+t细胞内可能只含有一个复制完全病毒的hiv感染细胞。因此，hivdna检测结果阴性与该临床样本中可能与患者接受cart治疗时间长、病毒抑制成功有关。

综上所述，本发明可用于目前我国hiv流行毒株的总hivdna定量。该方法操作简单，一天时间即可以完成从样本dna提取到实时荧光定量pcr扩增，价格相对低廉，可用于监测大型队列中hiv感染个体的持续性感染状况，评估cart治疗效果，也可以用于早期hiv感染的辅助诊断以及hiv阳性母亲新生儿感染的诊断。

序列表

<110>首都医科大学附属北京佑安医院

<120>可覆盖多亚型的hiv-1总dna定量检测引物对、探针及检测试剂盒

<130>bj18-0136-cn

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<170>siposequencelisting1.0

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