一种基于荧光编码微球的EGFR突变基因检测方法与流程

本发明涉及癌症患者egfr突变基因检测领域，尤其涉及一种基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法。

背景技术

人类表皮生长因子(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。egfr是her/erbb家族成员之一。egfr与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，经过细胞质中的衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、增值、分化和凋亡。当egfr发生突变时，egfr自身或配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增值。此外，egfr过度活化还可以启动多种蛋白水解和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，egfr过表达者通常预后较差。

易瑞沙和特罗凯作为egfr受体酪氨酸激酶抑制剂，是美国fda批准用于nsclc靶向治疗的主要药物。但是临床实验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的nsclc病人有显著的疗效。进一步的研究发现egfr基因突变与nsclc靶向治疗疗效相关，多数携带egfr基因突变的患者疗效显著。肺癌细胞中有egfr酪氨酸激酶基因编码区18-21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80％。如果病人不携带有egfr基因突变而服用此类药物，不仅会耽误病情还会造成巨额的药疗资源的浪费。因此，检测组织或血液中是否含有egfr基因突变对于指导nsclc病人临床用药，具有重要的参考价值，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。

然而egfr突变为体细胞突变，在肿瘤患者中突变的频率较高(美国nsclc患者中约10％有egfr基因突变，而亚洲人群这一比例约为30％)。但是突变基因与未发生突变的野生型基因相比，突变比例极低，根据不同肿瘤分期，这一比例通常为0.01％～10％。因此针对egfr突变基因的检测最大的难题是如何在大量野生型基因背景下检测出极少量发生突变的egfr基因。另外，由于已知可以靶向治疗有关的egfr突变类型高达40多种，因此如何实现单次有效检测40多种突变基因类型也是egfr检测技术的另一项挑战。目前检测基因突变的方法主要包括：直接测序法、传统的荧光定量pcr法、高分辨率溶解曲线法和探针扩增阻滞突变法(amplificationrefractorymutationsystem,arms)。测序法耗时长且灵敏度低，通常对含量超过5％的基因突变进行检测。因此该方法不适合应用于临床样本的分析。传统的荧光定量pcr法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易出现假阳性的检测结果；同时检测的位点数量和检测样本的通量都相对比较小。高分辨率溶解曲线法检测敏感性在5％左右，且所使用的仪器与相应配套的软件比较特殊，同时检测结果稳定性不佳，难以在医院进行普及。arms-pcr是利用pcr引物的3’末端碱基必须与模板互补才能有效扩增的原理，通过设计针对突变位点的特异性pcr扩增引物，进而达到检测突变基因的目的。虽然arms-pcr方法是一种较为简单、且灵敏度较高的检测方法，但是受限于pcr检测通道，难以实现对多种egfr突变基因进行同时检测。

现有的基于悬浮阵列芯片的多指标检测系统采用了含有编码信息的微球，具有能对蛋白质、核酸和细胞因子等同时进行定性和定量分析的优势，因此广泛应用于生命科学研究、疾病筛查、药物筛选以及临床诊断。悬浮阵列技术的核心部件是具有独特编码信息的微球。这些微球可以通过有机荧光染料、拉曼分子、量子点、聚合物量子点等光学材料进行光学编码。

为了同时解决现有egfr突变基因检测技术所面临的检测灵敏度差和检测通量低的问题，本发明提出了一种基于荧光编码微球的针对egfr突变基因中最常见的三种突变类型(19del，t790m和l858r，涵盖了32种亚型)的单管多重检测方法。该方法提出了一种含有用于扩增待检样品基因片段的arms-pcr引物组和特异性blocker组的modifiedarms-pcr扩增体系，以及固定有特定检测探针的多重荧光编码微球检测体系，和一种用于检测egfr突变基因的试剂盒。本发明具有灵敏度高、准确性高、特异性强，能同时检测出多种egfr突变基因的优点。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种能同时检测多种egfr突变位点的检测方法，该方法能同时保证检测方法的灵敏度和检测的准确性以及检测通量，同时该方法也易于大规模推广。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步：制备针对不同egfr突变位点的特异性检测探针，所述检测探针包括15-35bp的碱基序列，所述碱基序列的中部位置包含对应的egfr突变基因相应的碱基序列；

第二步：将针对不同egfr突变位点的检测探针分别固定在具有不同编码信息的荧光编码微球上，所述荧光编码微球能结合并固定检测探针；

第三步：制备对应不同egfr突变位点的扩增引物和针对不同位点用以提高反应特异性的blocker，所述一对引物中的至少一条引物使用报告荧光分子进行标记，然后利用modifiedarms-pcr体系扩增待检样品中含突变基因的片段；

第四步：将第三步扩增获得的基因片段与第二步所得的固定有检测探针的荧光编码微球进行杂交，从而达到荧光编码微球能特异性捕获目的扩增片段的目的；

第五步，通过流式细胞术或者荧光成像技术检测荧光编码微球的编码信息以及微球表面的报告荧光信号，确定待检样品是否存在以及对应的egfr突变类型。

优选的，所述的基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法，其特征在于，所述不同egfr突变位点包括19del，t790m和l858r中的至少一个。

优选的，所述的基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法，其特征在于，所述第三步中荧光标记分子为与荧光编码微球发射光谱不同的另一种报告荧光分子。

优选的，所述的标记物可通过荧光法的方式发出信号，并最终通过流式细胞术或者荧光成像技术进行检测。

优选的，所述的基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法，其特征在于，所述检测探针为seqid1-id3中的至少一个序列或者其反向互补序列。

优选的，所述的基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法，其特征在于，所述第三步中的扩增引物为以下3对中的至少1对：seqid4和seqid5；seqid6和seqid7；seqid8和seqid9。seqid4和seqid5对应的突变类型为19del；seqid6和seqid7对应的突变类型为l858r；seqid8和seqid9对应的突变类型为t790m。

优选的，所述的基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法，其特征在于，所述第三步modifiedarms-pcr扩增体系中还包括blocker序列，所述blocker的序列含有上述的基因突变位点，长度为10bp-25bp，所述的blocker碱基中含有pna或者lna修饰。

优选的，所述的基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法，其特征在于，所述blocker序列为seqid10–id12中的至少一个序列或者其反向互补序列。每一个所述blocker都对应至少一个所述的egfr突变基因类型，其中，seqid10对应的突变类型为ex19del，seqid11对应的突变类型为l858r，seqid12对应的突变类型为t790m。

本发明还提供了一种检测egfr突变基因的试剂盒，其特征在于所述检测egfr突变基因的试剂盒利用了上述任意一项方法进行检测，所述试剂盒包括固定有多个特异性检测探针的固相载体、含有多个扩增引物和多个blocker的modifiedarms-pcr扩增体系。

本发明与现有技术对比有益效果是：本发明是基于modifiedarms-pcr和荧光编码微球杂交检测技术上的egfr基因突变检测技术。由于modifiedarm-pcr和blocker的存在可以针对所需检测的突变基因类型进行特异性扩增，然后通过固定在荧光编码微球上的检测探针对扩增产物进行杂交检测。通过modifiedarms-pcr结合blocker的扩增策略联合荧光编码微球杂交检测技术能直接对待检者的基因突变类型能起到很好的判断，具有准确性高、特异性强；同时还具有高检测灵敏度的优势。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1.l858r突变基因样本经编码微珠检测后在fl4的荧光强度；

图2是本发明的一个较佳实施例的基于编码微球的egfr突变基因检测方法的l858r灵敏度；

图3是本发明的一个较佳实施例的基于编码微球的egfr突变基因检测方法的多重modified-arms-pcr的检测灵敏度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册见newyork:coldspringharborlaboratorypress的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法

第一步：偶联检测探针的荧光编码微球的制备

1)用130-150μl的100mmmes(ph4.5；casnumber:1266615-59-1)清洗0.25mg表面为羧基功能基团的荧光编码磁球3次。

2)加入氨基修饰的核酸探针，然后再加入新鲜配置的edc(casnumber:25952-53-8)溶液，使得edc浓度为40mg/ml。

3)室温下避光反应1h，反应结束后磁分离，将上清液转移至一新的0.5ml离心管中。

4)用130-150μl硼砂缓冲液(10mm，ph＝9.5，0.5％sds)清洗磁球3次，再用130-150μl1xte(ph7.6)清洗磁球3次。

5)加125μlddh2o混匀(磁球浓度为2μg/μl)，4℃保存。

第二步：待检样品pcr的扩增

根据本项目待检的egfr突变基因类型的位置关系，本实施例设计了3对引物针对不同的突变基因类型同时进行扩增。所述扩增引物包括：seqid4和seqid5；seqid6和seqid7；seqid8和seqid9。seqid4和seqid5对应的突变类型为19del；seqid6和seqid7对应的突变类型为l858r；seqid8和seqid9对应的突变类型为t790m。

上游引物和/或下游引物的5’端带有荧光素标记。其pcr扩增产物可与本发明实施例中的探针杂交。本实施例还包括blocker序列，其中每一个所述blocker都对应至少一个所述的egfr突变基因类型，其中，seqid10对应的突变基因类型为ex19del，seqid11对应的突变基因类型为l858r，seqid12对应的突变基因类型为t790m。

具体操作步骤如下：

提取模板dna：使用其他商业化试剂盒从病人的组织样本中提取模板dna。

配制pcr反应液：配制15微升/人份的pcr反应液，每人份的pcr反应液中各成分及浓度分别为：上游引物浓度分别为0.2微摩/升、taq酶为1u/反应、1xpcrbuffer、mgcl2为1.5毫摩/升、dntp为0.2毫摩/升、模板dna1-10纳克/微升以及block序列浓度0.2微摩/升。

modified-arms-pcr程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，70℃20秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环35次。pcr扩增后的产物包含待检测病人的dna片段。

第三步：杂交及流式细胞术检测，具体操作步骤如下：

1)pcr产物于95℃变性10min；于冰上冷却5min。

2)配置杂交体系，将三种固定了特异性探针的编码微球加入到杂交缓冲液中，然后加入变性后的pcr产物，于55℃分子杂交仪中杂交1h。

3)用130-150μl的2xssc缓冲液清洗1次，用130-150μl1xpbs液清洗1次。

4)用35μl的1xpbs液重悬。

5)流式细胞术检测分析(设置检测体积40μl，检测前震荡一下)图1为流式细胞分析结果示意图。

实施例2基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法的检测灵敏度

通过在反应溶液中分别加入10000个拷贝的野生模板和不同浓度(1，5.6，56，280和560拷贝)的l858r突变基因，然后再通过modified-armspcr进行扩增检测以验证其灵敏度(具体结果详见图2)。检测结果显示其能达到56个拷贝，并能对10000个拷贝的野生基因组能进行很好的抑制。

另外，通过在反应溶液中分别加入10000个拷贝的野生模板和不同比例的突变型基因(l858r、del19和t790m)，然后再通过多重modified-armspcr进行扩增检测以验证其灵敏度(具体结果详见图3)。检测结果显示其能达到0.1％，并能对10000个拷贝的野生基因组能进行很好的抑制。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

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