本申请属于食品病菌检测领域，具体涉及一种食品中副溶血性弧菌的快速检测和估数方法。
背景技术
副溶血性弧菌，广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，发病呈世界性分布，尤其在沿海地区发病较高，许多人因食用被本菌污染而又未煮熟的海产品而引起中毒，发病率高。在近年来沿海地区的微生物性食物中毒中，该菌已成为首要病原。
目前，我国常规检测方法大多要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等过程。这些实验操作繁琐，需耗时5-6d，检出率低，给海产品生产、出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难，不但影响经济发展，而且不利于及时诊断和控制流行病的传染，不能满足食品中病原菌快速检测的现实需要。另外，传统硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂培养基(tcbs)的选择效果不明显，可疑菌落不易识别，当有其他的弧菌或肠道菌群存在时会影响副溶血性弧菌的检出，给检测技术人员带来极大的工作量与不确定性。
近年来，分子生物学的检测技术已被广泛应用，使副溶血性弧菌的快速检测有了很大发展。但是这些技术需要的设备费用较大、技术要求高、操作复杂，在基层检测机构不易推广。而显色培养基因为将微生物的分离与鉴定合二为一，具有省时省力、操作简便、敏感性和特异性都较高的优点，特别是能与常规检测方法较好地接轨而越来越受到国内外的关注。显色培养基是根据酶的特征设计的对微生物进行快速检测的一种分离培养基，基本原理是：在分离培养基中加入检测某些菌种的特异性酶底物，该底物为人工合成，由产色基团和微生物可代谢物质组成，通常为无色，但在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色，直接观察菌落颜色即可对菌种做出初步鉴定，具有快速、简便和经济的特点。而现有的针对副溶血性弧菌的显色培养基，检测结果不够准确，现在急需一种检测结果准确、检测效率高的副溶血性弧菌的显色培养基。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用显色培养基对食品中的副溶血性弧菌快速检测和估数的方法，检测结果准确、检测效率高，同时还能对食品中的副溶血性弧菌进行估数，初步确定食品中副溶血性弧菌的数量级。
本发明采用的技术方案如下：
一种食品中副溶血性弧菌的快速检测和估数方法，包括以下步骤：
(1)、配置牛肉膏蛋白胨培养基：取新鲜牛心200g，用刀剁成肉末后，加入500ml蒸馏水、1g牛肉膏、5g蛋白胨、2g氯化钠、5g琼脂，用10％盐酸调整ph到7.8；并于121℃灭菌30min，冷却至常温；然后，对培养基和培养室紫外灭菌20min，关灯90min后使用。
(2)、预增菌处理：称量待测样品10g至含牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，300rpm下振荡15min，于39℃培养24h。
(3)、第一次热处理：将培养过的样品混合物倒入已灭菌的培养皿中，液面高度为1cm，先40士1℃培养0.5h，然后50士1℃培养1h；
(4)、配置增菌剂、增菌：增菌剂配方为：按重量份计，1.5％酵母粉、3％氯化钠、1％亚碲酸钠、0.5％磷酸氢二钾、1.5％氢氧化钾、0.5％乙酰胆碱，其余为蒸馏水；增菌剂ph为9.5左右，使用前需121℃灭菌30min；
将经过第一次热处理的样品混合物加入到生理盐水中，制成样品质量浓度为10％的样品匀液；按1∶100的质量比将增菌剂溶于蒸馏水中，得增菌液；将样品匀液与增菌液按1∶3.5的体积比混匀，37℃震荡培养7h，得样品增菌液；
(5)、第二次热处理：将样品增菌液倒入已灭菌的培养皿中，液面高度为1cm，先30℃培养0.5h，然后35℃培养0.5h，40℃培养0.5h，45℃培养1h，50℃培养1h；
(6)、冷处理：将第二次热处理后的样品增菌液直接放入4℃冰箱，冷却2h后取出，缓慢升至室温备用。
(7)、配置显色培养基：显色培养基各组分的重量份为：胰蛋白胨10份，肝浸粉5份，酵母提取物2份，葡萄糖1份，硫代硫酸钠0.3份，环丝氨酸0.5份，5-溴-4-氯-3-吲哚-丁酸盐0.1份，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃半乳糖苷0.05份，磷酸酯二钠盐0.025～0.05份，过氧化月桂酰0.01份，乙酰胆碱0.02份，乙酸乙酯0.015份，去离子水100-500份，最终ph为8.0～8.2。
(8)、建立副溶血性弧菌显色时间表：取步骤(7)中的显色培养基，加入副溶血性弧菌，配制成副溶血性弧菌浓度梯度范围为104-108cfu/ml的显色反应液，密封后培养并进行显色反应，副溶血性弧菌置于上述显色培养基中显示红色，根据不同浓度的副溶血性弧菌显色反应液完全显色为红色的显示时间，建立显色时间表。
(9)、副溶血性弧菌的培养显色：取步骤(6)中冷处理后备用的样品，置于步骤(7)的快速显色培养基中进行培养并进行显色反应；在显色反应过程中观察样品，其中样品颜色转变为红色的是阳性样品，样品颜色不变的是阴性样品；记录阳性样品完全变为红色的时间，根据步骤(8)的显色时间表，初步确定副溶血性弧菌的数量级。
本发明的技术效果是：克服了现有技术的不足，提供了一种检测结果准确、检测效率高的副溶血性弧菌检测方法。采用了专门的增菌剂，有效提高了增菌效果；通过对样品进行预增菌、热处理、增菌、热处理、冷处理等操作，大大提高了样品中副溶血性弧菌的被测出率；采用了专门的显色培养基，提高了副溶血性弧菌显色效果，从而提高了检测结果的准确度；在检测副溶血性弧菌的同时，还能对其进行估数，初步确定食品中副溶血性弧菌的数量级。
具体实施方式
一种食品中副溶血性弧菌的快速检测和估数方法：
(1)、配置牛肉膏蛋白胨培养基：取新鲜牛心200g，用刀剁成肉末后，加入500ml蒸馏水、1g牛肉膏、5g蛋白胨、2g氯化钠、5g琼脂，用10％盐酸调整ph到7.8；并于121℃灭菌30min，冷却至常温；然后，对培养基和培养室紫外灭菌20min，关灯90min后使用。
(2)、预增菌处理：称量待测样品10g至含牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，300rpm下振荡15min，于39℃培养24h。
(3)、第一次热处理：将培养过的样品混合物倒入已灭菌的培养皿中，液面高度为1cm，先40士1℃培养0.5h，然后50士1℃培养1h；
(4)、配置增菌剂、增菌：增菌剂配方为：按重量份计，1.5％酵母粉、3％氯化钠、1％亚碲酸钠、0.5％磷酸氢二钾、1.5％氢氧化钾、0.5％乙酰胆碱，其余为蒸馏水；增菌剂ph为9.5左右，使用前需121℃灭菌30min；
将经过第一次热处理的样品混合物加入到生理盐水中，制成样品质量浓度为10％的样品匀液；按1∶100的质量比将增菌剂溶于蒸馏水中，得增菌液；将样品匀液与增菌液按1∶3.5的体积比混匀，37℃震荡培养7h，得样品增菌液；
(5)、第二次热处理：将样品增菌液倒入已灭菌的培养皿中，液面高度为1cm，先30℃培养0.5h，然后35℃培养0.5h，40℃培养0.5h，45℃培养1h，50℃培养1h；
(6)、冷处理：将第二次热处理后的样品增菌液直接放入4℃冰箱，冷却2h后取出，缓慢升至室温备用。
(7)、配置显色培养基：显色培养基各组分的重量份为：胰蛋白胨10份，肝浸粉5份，酵母提取物2份，葡萄糖1份，硫代硫酸钠0.3份，环丝氨酸0.5份，5-溴-4-氯-3-吲哚-丁酸盐0.1份，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃半乳糖苷0.05份，磷酸酯二钠盐0.025～0.05份，过氧化月桂酰0.01份，乙酰胆碱0.02份，乙酸乙酯0.015份，去离子水100-500份，最终ph为8.0～8.2。
(8)、建立副溶血性弧菌显色时间表：取步骤(7)中的显色培养基，加入副溶血性弧菌，配制成副溶血性弧菌浓度梯度范围为104-108cfu/ml的显色反应液，密封后培养并进行显色反应，副溶血性弧菌置于上述显色培养基中显示红色，根据不同浓度的副溶血性弧菌显色反应液完全显色为红色的显示时间，建立显色时间表。
(9)、副溶血性弧菌的培养显色：取步骤(6)中冷处理后备用的样品，置于步骤(7)的快速显色培养基中进行培养并进行显色反应；在显色反应过程中观察样品，其中样品颜色转变为红色的是阳性样品，样品颜色不变的是阴性样品；记录阳性样品完全变为红色的时间，根据步骤(8)的显色时间表，初步确定副溶血性弧菌的数量级。