一种筛选促骨细胞生成的间充质干细胞的方法与流程

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种筛选促骨细胞生成的间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)作为细胞治疗的理想种子细胞，经过长期体外和动物疾病模型治疗的研究，已经被广泛地应用于临床上损伤、衰老等病变引起的各种组织器官损伤修复，主要包括骨重建和再生、神经退行性病变和损伤、心肌损伤、肝硬化、糖尿病、肺部疾病等。其中，间充质干细胞在骨科相关疾病运用最早，如骨关节炎、股骨头坏死、脊髓损伤、成骨发育不全和低磷酸酯酶症等，它相应的临床安全性和有效性已经得到了初步的验证，但治疗效果还是有一定的差异性。客观分析原因发现间充质干细胞在骨科治疗中依旧存在许多问题，如：(一)细胞制剂方面：①不同来源、不同状态的间充质干细胞数量和质量具有异质性；②大多数机构都采用单纯的贴壁法分离培养mscs，细胞的纯度和干性不能保证；③如何保证注射后的mscs具有一定的生物安全性。(二)临床疾病方面：①不同骨科疾病种类复杂多样，如何制定合理的个体化治疗方案，包括制定mscs注射方式、剂量、次数、时间窗等；②如何调控mscs在体内的增殖和分化，实现真正的“根治”效果。这些问题都要多方面机构共同协商和解决才能将问题迎刃而解，才能确保mscs在相关适应症治疗中的治愈效果，才能推动mscs在治疗中的应用研究。因此，我们先从间充质干细胞制备工艺、细胞质量以及生物活性多方面评估方面入手，拟开发并鉴定、筛选出一种可以真正维持“干性”和并促进机体骨细胞的分化的特异性间充质干细胞，以确保间充质干细胞在临床试验前的“生物活性”。

目前，关于间充质干细胞具有促骨细胞生成和骨修复潜能的生物标记物，在骨修复方面，大多数集中在生物材料搭建mscs的治疗研究、小分子或者培养体系改造mscs的研究(即非基因编辑技术改造的mscs)和基因编辑技术改造mscs的治疗研究三大类。

但是目前针对上述理论的研究还存在一些问题：

(1)中国专利cn107849533a“间充质干细胞用于治疗骨关节炎的用途”中公开了经低氧培养(低于10％氧气)的mscs不仅可以增强其在体内的存活能力，还能促进血管损伤和骨关节炎等疾病的修复功能，这是一种非常简易、高效的方法。但是低氧培养间充质干细胞的主要目的是延缓间充质干细胞的过渡扩增造成的细胞衰老，避免一些衰老的间充质干细胞在正常氧浓度条件下造成氧化应激损伤。这种低氧培养条件下的间充质干细胞最终能扩增的代数，细胞能维持的最适应特性情况都需要继续研究。而专利cn105441389a“促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法”中公开了采用a-mem+5％血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/l胰高血糖素样肽-1这种培养体系可以提高骨髓间充质干细胞内决定成骨再生的关键转录因子(osterix、runx)的基因以及骨再生早期代表性因子的基因-骨桥蛋白(opn)和碱性磷酸酶(alp)的表达。但是这种基因高表达的方法需要复杂的培养体系，最终还需要适合的检测手段。

(2)基因编辑修饰的mscs方面：

虽然cn107828719a：“gdf11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用”和cn104004711a：“一种提高人间充质干细胞分化能力的方法”均公开了可以提高间充质干细胞向成骨细胞分化的能力，但是这种方法目前还仅处在动物实验研究，尤其转染基因的分布及表达情况缺乏有效的检测方法、其安全性的问题仍然阻碍其临床应用。最重要的获取可用于临床应用的载体非常耗时且耗费高。因此，经基因修饰的msc离临床应用仍尚有距离。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种以grem1为标识物筛选具有较强的促骨细胞生成能力的间充质干细胞的方法。

本发明的目的是提供一种grem1在筛选具有促骨生成的间充质干细胞中的应用。

本发明的另一目的是提供一种筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法。

本发明的再一目的提供一种筛选得到的促骨生长的间充质干细胞在制备治疗骨病的药物中的应用。

本发明人在前期开展了筛选特异性的间充质干细胞的相关研究，通过寻找可以评价间充质干细胞(mscs)的我更新能力、分化能力和免疫调节能力的特异性标志物时，能透过这些标志物筛选出适于“适应症”的干细胞治疗，提高间充质干细胞的治愈率。发明人的基因组学检测发现：那些自我更新能力强的间充质干细胞比生长慢的间充质干细胞高表达gremlin1(简称：grem1)，而且这种高表达grem1基因的间充质干细胞对自身的表型、免疫调节、分化能力和旁分泌能力均没影响。而且成骨，成脂检测分化实验也发现：高表达grem1的间充质干细胞成骨分化能力比未筛选的常规的间充质干细胞强，在成脂分化能力方面确极大减弱。因此，我们认为grem1不仅可以作为评价msc干性的功能指标，还作为评价间充质干细胞具有促骨细胞生成和修复的应用指标和评价标准。因此本发明将grem1作为标志物应用于筛选具有促骨生成的间充质干细胞。本发明提供的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，标志物为grem1，通过检测间充质干细胞中grem1的浓度，筛选grem1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞，得到促骨生成能力强的间充质干细胞。

筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，优选地，包括以下步骤：

(1)培养间充质干细胞，然后处理间充质干细胞，得到间充质干细胞的待检测样品；

(2)利用吸光度法测定步骤(1)中处理过的间充质干细胞的待检测样品的中grem1的浓度，筛选grem1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞。

更加具体的方法为采用elisa检测间充质干细胞上清液中的grem1含量，从而确定间充质干细胞的促骨生成能力。由于间充质干细胞分泌的grem1是一种可溶性因子，通过elisa方法检测不同培养条件、不同来源以及不同代次的msc培养基上清的grem1的表达量，通过评估grem1的含量推测间充质干细胞促血管生成和修复的能力。

具体步骤如下：

(1)当间充质干细胞长满细胞培养瓶50％～60％时，分别弃掉培养基，按照实验体系更换成无血清的基础培养基(可为不同品牌的dmem/f12或者a-mem培养基)继续培养细胞48h(一般t75体积为10ml，t175体积为25ml)，然后收上清，4℃下3000rpm离心20分钟收上清，弃沉淀；最后将上清液样品冻存于-80度备用；

(2)分别采购包被好的grem1elisa试剂盒，加样：分别设空白孔(空白对照不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、标准孔、待测样品孔；在酶包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(3)温育：用封板膜封板后37℃温育30分钟；

(4)配液：将n倍浓缩洗液用蒸馏水n倍稀释后备用，n为任意正数；

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；

(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

(7)显色：每孔加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

(8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色变黄色)；

(9)测定：以空白调零，450nm播出依序测量各孔的吸光度，测定在加入终止液15min内进行；

(10)结果分析：根据吸光度(od值)和标准品绘制标准曲线，换算待测样品的浓度，筛选grem1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞。

进一步优选地，采用低氧培养技术，即在氧浓度为1-5％的低氧培养箱下对间充质干细胞进行培养，确保间充质干细胞在大量扩增培养时，减缓复制性衰老的过程，促进间充质干细胞的grem1基因表达产生更多的grem1，从而筛选培养出高表达grem1的间充质干细胞。进一步优选地，筛选间充质干细胞的grem1的基因相对表达量为常氧浓度的8.8倍以上的促骨生成间充质干细胞，其中常氧浓度为21％，这样的促骨生成的间充质干细胞中的grem1基因得到更大程度的表达，产生更多的grem1，通过这样的方式，能够筛选培养出更加适宜的促骨生成的间充质干细胞。

虽然间充质干细胞为骨科疾病的治疗开辟了新道路，但实际治疗应用中的疗效存在差异。因为根据目前分离mscs的方法，msc仍存在异质性，是一群表现和功能上多样性的混合干细胞。本发明人开展了一些列大规模的干细胞体系验证和研究，发现检测间充质干细胞的群体倍增时间(popμlationdoublingtime，pdt)(pdt：系指细胞增殖一倍所需要的时间。)是确保间充质干细胞生物学特性的基础。这是由于间充质干细胞比大多数正常外培养细胞增殖能力强，进而自身的pdt小；但与恶性转化的细胞的增殖能力相比，又相对较弱，不存在无限增殖的情况。因此间充质干细胞在体外培养的过程中，很容易因内外因素的变化，细胞逐步发生衰老，衰老的细胞往往伴随着增殖速度的减缓，或丧失增殖能力。因此采用间充质干细胞的群体倍增时间评价间充质干细胞的能力尤为重要。

根据间充质干细胞这些特性，发明人前期也开展不同培养体系或和同一培养体系下，不同pdt的脐带间充质干细胞(uc-msc)分泌grem1的表达情况。通过采用qrt-pcr基因检测方法发现：①同一代次，低氧条件下培养的mscs增殖能力强，进而pdt比常氧培养条件下的mscs的pdt小。经检测的低氧mscs(pdt为18h)，同代次条件下，常氧培养的mscs(pdt为25h)，基因检测结果发现：低氧培养的msc的grem1基因的表达量是常氧间充质干细胞的8倍。②同时，我们还筛选低氧和常氧培养条件下，pdt相同的mscs，我们发现当同时筛选pdt均为25h的mscs进行qrt-pcr检测时，这两种细胞的grem1基因表达无显著性差异。这些结果说明，无论采用什么培养体系，当能维持间充质干细胞的pdt在一定合理范围内，间充质干细胞则具有良好的自我更新和分化潜能，因此可通过筛选同一来源mscs代次的pdt时间也能评估间充质干细胞表达grem1的强弱。因此，优选的，间充质干细胞的倍增时间在25h以下，能够筛选出高表达的促骨生成的间充质干细胞。

优选地，本体系中还能够采用细胞倍增时间评价的间充质干细胞的促骨生成能力，筛选出具有良好的促骨生成的间充质干细胞，

包括以下具体步骤：

培养间充质干细胞，连续检测多天细胞倍增数目，每天在固定时间进行细胞消化，计数，根据公式计算倍增时间，

pdt＝(δt×log2)/(lognt-logn0)，

其中，pdt为细胞倍增时间，δt为隔天数，nt为对数生长期任一点的理论观察者，n0为对数生长期理论初始值，n0在接种细胞24小时后进行计算群体倍增时间；

筛选出细胞倍增时间小于25h的间充质干细胞。

更加具体的方法包括以下步骤：

(1)将消化下来的间充质干细胞，根据细胞悬液密度，对细胞进行6孔板铺板，细胞数为：5×10³个/孔，每孔总体积v＝2ml/孔；

(2)连续检测6天细胞倍增数目，每天进行三个复孔重复实验；

(3)每天在指定时间点进行细胞消化，细胞仪计数，并比较三个复孔间的细胞数；

(4)待6天细胞群数目检测完毕，根据公式计算倍增时间；

pdt＝(δt×log2)/(lognt-logn0)，其中，δt为隔天数，nt为对数生长期任一点的理论观察者，n0为对数生长期理论初始值，一般n0在接种细胞24小时后进行计算群体倍增时间；

由于不同来源的间充质干细胞pdt不同，一般pdt<25h细胞增殖能力强，更合适用于治疗和研究，因此筛选出pdt<25h的间充质干细胞。

本技术方案检测grem1的方法仅是通过elisa检测msc培养基上清的方法进行评估，不需要消化细胞，无形中减少了浪费细胞的成本。按检测细胞含量通常采用100万个细胞(假设优质的干细胞，按平均市场价售价至少1万左右，而且检测试剂费，比如pcr相关试剂盒，westernblot相关抗体和和其他耗材等，试验成本最低也是2-3千，总和也是1.2万不止)。因此生产过程中，每检测一批，传统检测其msc膜蛋白的方法至少上万价格，相比elisa试剂盒的不足1000元的成本，本技术方案极检测成本极低。

本发明筛选出来的促骨生成的间充质干细胞具有较高的生物活性和良好的促骨生成的能力，在治疗骨病特别是修复骨关节炎及软骨缺损等疾病有良好的疗效。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种将grem1作为标志物应用于检测间充质干细胞的生成骨细胞的能力，本发明的方法不依赖病毒转染这种基因工程技术，借助细胞倍增时间这种量化指标，结合低氧培养这种经济、适用的手段即可精准筛选出可促进骨细胞生成的高表达grem1的间充质干细胞，通过检测间充质干细胞上清液中grem1的含量，当grem1的含量在5.37μg/ml以上，得到的间充质干细胞具有良好的分化成为骨细胞的能力，具有治疗骨损伤和促进骨修复能力，本发明提供的方法不仅操作简单，省时省力，还降低检测费用的经济成本，实践性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是msc在常氧和低氧培养条件下表达grem1基因的水平；

图2是msc在常氧和低氧条件下分泌grem1蛋白情况；

图3是关节腔注射间充质干细胞治疗4周各组织情况。

图3中自左到右为统一标本的he染色、番红o染色及阿利新蓝染色。a为低倍图，b为高倍图，高倍图为低倍图片虚线框内部分，低倍图片比例尺为500μm，高倍图片比例尺为200μm。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

msc在常氧和低氧培养条件下，对grem1基因表达的影响

(一)目的：评价为间充质干细胞在5％低氧培养条件和常氧(21％)条件下grem1的基因表达水平。

(二)实验方法：

1.分别将p3代次的msc按100个/cm²细胞密度铺于25cm²细胞培养瓶，然后分别置于常氧培养箱和5％低氧培养箱培养，长至80％～90％后同时收细胞待用。

2.分别向细胞加入1mltrizol试剂吹打混匀，静置5min，使核蛋白充分解离；加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min；于2-8℃12000g离心15min，离心后样品分层，上层水相中含rna，下层有机相中含蛋白和dna。取上清液，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为rna。于2-8℃12000g离心10min后弃去上清。向沉淀中加入1ml75％乙醇，轻轻混匀。于2-8℃12000g离心5min后弃上清。将rna样品晾干(不要彻底干燥)，加入适量depc水溶解，nanodrop定量。

3.逆转录：根据takara公司的rt-pcr试剂盒，逆转录体系如下：反应体系20μl，

4.反应条件：

①总rna于70℃孵育10min，离心后置于冰上；

②室温保温10min，然后在42℃保温15min，然后在95℃保温5min，然后在0-5℃保温5min，最后在-20℃保存。

5.将mrna反转录成cdna，最后做荧光定量pcr，荧光定量pcr，反应体系如下：反应体系20μl，即：

三蒸水7μl，每个样本设三个复孔。

6.扩增条件为：预变性95℃10min，进入循环，95℃15s，60℃60s，扩增40个循环。以β-actin作为内参照校正，用2△△ct法分析基因的相对表达；以对照组表达量为1，计算其它各组相对于对照组的表达量来进行统计学分析。

7.研究中使用使用到的引物序列为：

human-grem1正向引物：5′ttaagcagaccatccacga3′；

human-grem1反向引物：5′tgtagttcagggcagttgagt3′；

human-beta-actin正向引物：5′catgtacgttgctatccaggc3′；

human-beta-actin反向引物：5′ctccttaatgtcacgcacgat3′。

(三)实验结果：

结果如图1所示，与常氧msc表达grem1相比，5％低氧可以显著诱导msc高表达grem1基因，其grem1基因相对表达量是常氧培养的8.89倍。这说明不需要借助慢病毒转染技术，即可提高grem1的表达。

同样的方法测试msc在低氧(1％)培养条件下grem1基因表达，测试结果表明，在1％的低氧条件下能够更加显著的诱导msc高表达grem1基因，其grem1基因相对表达量是常氧培养的10倍以上。

实施例2

msc在常氧和低氧条件下分泌grem1蛋白情况。

(一)实验目的：elisa评价为间充质干细胞在5％低氧培养条件和常氧条件下grem1因子表达情况。

(二)实验方法：

1.将细胞分别铺于t75(一般t75体积为10ml，t175体积为25ml)培养瓶，分成常氧对照组1瓶和5％低氧实验组1瓶，每瓶4×10⁵个/瓶，总体积为10ml/瓶。一天后分别换成无血清的基础培养基10ml培养细胞48h，然后收上清，4℃下3000rpm离心20分钟收上清液，弃沉淀。最后将上清样品冻存于-80度备用。

2.加样：分别设空白孔(空白对照不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、标准孔、待测样品孔。在酶包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

3.温育：用封板膜封板后37℃温育30分钟；

4.配液：将30倍浓缩洗液用蒸馏水30倍稀释后备用；

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

7.显色：每孔加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色变黄色)；

9.测定：以空白调零，450nm播出依序测量各孔的吸光度。测定在加入终止液15min内进行。

(三)实验结果：

如图2的elisa结果显示，常氧的msc分泌grem1的量为1.86±0.32ng/ml；而低氧的msc分泌grem1的量为5.78±0.41ug/ml，显著高于常氧msc分泌含量。

实施例3

不同强弱grem1的间充质干细胞对修复骨关节炎软骨缺损的效果的。

(一)实验目的：不同强弱grem1的间充质干细胞对修复骨关节炎软骨缺损的效果的影响。

(二)实验方法：

1.细胞培养：由于实施例1已经证明，低氧可以诱导间充质干细胞grem1高表达。因此本次实验依旧采用实施例1的细胞培养方法，将低氧(本次实验采用5％o2体积分数)和常氧(21％o2体积分数)培养条件下的间充质干细胞当成高低两种gremlin1的间充质干细胞，进行疾病模型小鼠治疗。即：分别将p3代次的msc按100个/cm²细胞密度铺于t175cm²细胞培养瓶，加入25ml含有15％fbs或者5％血清替代物的a-mem培养基，然后分别置于常氧培养箱和5％低氧培养箱培养，长至80％～90％后同时收细胞待用。

2.构建小鼠膝关节前交叉韧带建立骨关节炎模型实验动物：scid小鼠分别用体积分数3.5％水合氯醛(10μl/g)腹腔注射麻醉小鼠后，常规备皮消毒手术区域。取髌旁内侧切口，切开皮肤及关节囊进入关节腔向外侧牵开髌骨，尽量屈曲膝关节显露前交叉韧带及内侧半月板前角，切断双侧前交叉韧带并行前抽屉试验确认已完全切断。术中注意保护关节软骨面。生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合关节囊及皮肤。

建模后2周，将建模成功的36只scid小鼠随机分为3组，每组12只。

1)生理盐水组为0.1ml生理盐水膝关节腔内注射；

2)常规治疗组：0.1ml含5×10⁶的常氧培养的间充质干细胞；

3)特异性治疗组：0.1ml含5×10⁶的低氧培养的间充质干细胞。

注射后4周分别处死各组小鼠，取双侧膝关节标本，进行he、番红o和阿利新蓝染色。甲苯胺蓝染色和及ⅱ型胶原免疫组织化学检测，并根据改良mankin评分表对各组软骨情况进行评分，评价这些间充质干细胞治疗效果。

(三)实验结果：

如图3结果显示，通过进行he、番红o和阿阿利新蓝染色，我们发现：与生理盐水组相比，低氧诱导的高表达grem1的间充质干细胞治疗组效果最好，其次是常规培养的低表达grem1间充质干细胞组。在高表达grem1的细胞治疗组中，通过图片可以看到改组软骨厚度恢复最好，软骨面光滑。番红o染色及阿利新蓝染色可见修复软骨组织内颜色均较深，证明生成的成骨细胞和软骨细胞比其他组多，因此改组修复效果明显高于其他组。

以上的实施例的结果表明，通过合理的pdt倍增时间和低氧量能够筛选出的间充质干细胞具有良好的促进骨生成的能力，而较低的pdt倍增时间和1-5％低氧量条件下培养筛选出来的间充质干细胞具有高grem1基因表达，产出更多的grem1，因此通过检测间充质干细胞中grem1的浓度，grem1的浓度在5.37μg/ml以上，则间充质干细胞就有良好的生物活性，能够生成成骨细胞和软骨细胞，具有良好的促骨生成能力。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。