肽及其制备方法和用途与流程

本发明属于基因工程
技术领域：
，涉及肽及其制备方法和用途。
背景技术：
：皮肤除皱是人类希望永葆青春的美好愿望。人类研究证实，皱纹的产生与面部肌肉纤维过度刺激有关。因此，从理论上来讲，可以通过直接减少肌肉运动收缩来减轻皱纹的产生。肌肉的收缩是由神经递质调控的，而snare复合物则是神经递质传递的信号来源。目前市场上广泛使用的肉毒素正是通过抑制snare复合物的功能抑制神经细胞的活性，进而达到去除皱纹的目的。但是，肉毒素的副作用非常巨大，人类一直在研究肉毒素的功能类似物，力求在达到相同目的的前提下尽量减少其副作用。lipotec公司发现的argireline就是一种肉毒素的功能类似物。argireline由6个氨基酸组成，氨基酸组成为ac-eemqrr-nh2。功能实验证实，argireline有很好的皮肤渗透性，并可以有效抑制snare的功能，具有很强的抗皱去皱活性，也被称为六肽。目前，已经有很多国家的知名化妆品品牌的许多系列添加了argireline六肽作为除皱的有效成分。我国一些生物科技公司也有该产品销售。但是，目前六肽的制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。因此，为了能使这类短肽类的皮肤营养产品不断走近百姓的日常生活，使得普通人拥有安全、稳定、实用的高品质化妆品，有必要设计研发更加稳定高效的除皱短肽，并探索大规模制备除皱短肽的技术。技术实现要素：在一方面，本发明提供了肽，其包含以seqidno.1所示的序列或以seqidno.1所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸的序列，所述肽显示抑制神经细胞的活性或除皱活性。在另一方面，本发明提供了编码肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，核苷酸序列包含以seqidno.3所示的序列。在又一方面，本发明提供了包含核苷酸序列的载体。在又一方面，本发明提供了包含载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。在又一方面，本发明提供了制备肽的方法。所述方法包括：(1)用包含多核苷酸序列的载体转化宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，其中所述多核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含本发明的肽；(2)在适当的条件下培养所述宿主细胞；并且(3)收集并纯化表达的多肽；(4)任选地切割多肽以获得本发明肽，其中所述切割优选用羟胺裂解法进行。在一个实施方案中，多肽包含1个以seqidno.1所示的序列或多个以seqidno.1所示的序列的重复单元。优选地，多肽包含2、3、4、5、6、7、或8个以seqidno.1所示的序列的重复单元。在一个实施方案中，重复单元可以是连续的或者可以间隔一个或多个氨基酸残基。在又一方面，本发明提供了除皱用组合物，其包含本发明的肽。在又一方面，本发明提供了本发明的肽用于抑制神经细胞的活性的用途或用于除皱的用途。与现有技术相比，本发明具有以下特点：1、本发明所公开的除皱短肽e8(geemqrrn)，为长期筛选优化的序列，水溶性好，稳定性强。发明人在实践中发现与argireline相比，argireline的n和/或c端的各种氨基酸添加变体未取得更好的除皱效果，相反在一定程度上减弱argireline的除皱性质。因此，认为不适合对argireline的c端和/或n端增加额外的氨基酸残基。然而，令人惊讶地，发明人发现与现有技术的argireline或其变体相比，除皱短肽e8(geemqrrn)具有类似的除皱效果。2、本发明所公开的新型除皱短肽e8的制备方法，采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本非常低，而且通过多肽基因的串联表达可以进一步提高产量。相对传统多肽的化学合成工艺，具有显著的成本优势。目前在宿主细胞，例如大肠杆菌中无法实现argireline多肽的大规模发酵制备。发明人首次实现了除皱短肽在宿主细胞，例如大肠杆菌中的大规模发酵制备。3、本发明所公开的新型除皱短肽e8的制备方法，产物纯度高，利用质谱方法检测分子量正确，无明显杂质成分。4、本发明人在之前的探索实践中，曾经发明了一种除皱短肽及其制备方法(专利申请号201510252409.7)，其名称为re14，其氨基酸序列为gpeemqrrlevlfq，通过发酵法实现了该除皱短肽的发酵制备。然而，本发明所公开的除皱短肽e8(geemqrrn)具有更显著的优势，包括a)分子量的优势，e8分子量为1019da，re14分子量为1733da，e8更小的分子量更利于多肽的透皮吸收和转化利用；b)使用效果的优势，re14的发明中并未公开使用效果，而本发明中的e8使用后具有显著的除皱效果；c)发酵产量的优势，re14的发酵实验中1l菌液能够提纯出大约20mg的多肽，e8通过序列的优化能能够在1l菌液中提纯出50mg以上的多肽，具有显著优势；d)发酵工艺的优势，re14的多肽纯化过程中需要加入另外的蛋白酶，成本较高，但是e8的纯化采用羟胺裂解法，大大降低了工艺成本。综上所述，本发明公开的新型除皱短肽e8水溶性好，稳定性强，纯度高，生产工艺简单，成本低廉，能够让除皱皮肤产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。附图说明图1为本发明表达载体的质粒图谱示意图，具体选择的表达载体为pet-32a，选择的串联重复数为8，即pet-32a-e8-8表达载体。图2为本发明表达出融合蛋白的羟胺酶切效果，具体选择的表达载体为pet-32a-e8-8。酶切后多肽浓度约为1mg/ml。图3为本发明纯化出的e8多肽的质谱检测结果。e8多肽的理论分子量为1019.07da。用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪maldi-tofaxima-cfrplus(kratosanalytical，shimadzucorporation，japan)在线性模式下进行分析，显示多肽分子量正确，没有降解。图4：涂抹除皱短肽e8或纯净水后皱纹深度的对比情况。纵坐标为皱纹深度(μm)。具体实施方式在下文更详细描述了本发明。本发明的肽包含基本单元e8，由8个氨基酸所组成。氨基酸序列为：gly-glu-glu-met-gln-arg-arg-asn，或简写为geemqrrn，在本文中也以seqidno.1表示。e8的理论分子量为1019.07da。可以通过将多肽基因串联表达来明显提高多肽表达效率。串联的个数可以从n中优化选择，表示为e8-n，其中n为1以上的整数。例如，1重复的基因e8-1氨基酸序列为geemqrrn(seqidno.1)，2重复的基因e8-2氨基酸序列为geemqrrngeemqrrn(seqidno.2)，3重复的基因e8-3氨基酸序列为geemqrrngeemqrrngeemqrrn(seqidno.3)，4重复的基因e8-4氨基酸序列为geemqrrngeemqrrngeemqrrngeemqrrn(seqidno.4)，等等。可以通过多种生产工艺进行制备本发明的肽。可以通过传统的化学合成的工艺进行制备，还可以通过发酵的工艺进行重组表达制备，例如利用大肠杆菌发酵。本发明的肽可以由核苷酸序列编码，例如由ggtgaggaaatgcagcgccgcaatggcgaagaaatgcagcgccgcaatggcgaagagatgcaacgccgcaatggcgaggagatgcagcgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaatggcgaggagatgcaacgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaacggcgaagaaatgcaacgccgcaat(seqidno.5)的核苷酸序列编码。应当理解，由于密码子简并性，本领域技术人员容易在保留初始氨基酸序列的前提下改变核苷酸序列。可以通过常规技术将核苷酸序列克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到宿主细胞中。转化方法包括但不限于电穿孔、cacl2转化等等。在本发明中，表达载体可以是pet26，pet32，pgex-6p等常用载体。本发明的肽可以由不同生物体表达，所述生物体包括但不限于动物细胞、植物细胞、微生物细胞，诸如原核生物和真核生物。优选地，在本发明中使用微生物细胞发酵产生本发明的肽。微生物细胞可以是肠杆菌科细胞，例如大肠杆菌细胞，例如bl21。应当理解，本领域技术人员可以选择适当的细胞来表达本发明的肽。可以通过常规方法制备并生成本发明的肽。例如，可以在培养基中在适当的条件下培养转化有本发明的多核苷酸的宿主细胞，如大肠杆菌；然后通过常规的分离和纯化技术分离本发明的肽。分离和纯化技术包括但不限于透析、硫酸铵沉淀、高效液相层析。本发明的肽包含以seqidno.1所示的序列或或以seqidno.1所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸的序列，所述肽显示抑制神经细胞的活性或除皱活性。“数个”可以是2、3、4、5、6、7、或8个。氨基酸取代意味着在相同位置，某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代。插入的氨基酸残基可以在任何位置插入，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻。可以从seqidno：1的序列中删除1、2或3个氨基酸，只要所述肽显示抑制神经细胞的活性或除皱活性。本领域技术人员已知，本发明所述的肽可以在氨基酸序列之间的一个或多个位置进行翻译后修饰。翻译后修饰的例子可以包括磷酸化作用、乙酰化作用和脱酰氨基作用。本发明还提供seqidno：1所示的肽的类似物，只要类似物显示抑制神经细胞的活性或除皱活性。这些类似物与天然的肽差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与seqidno：1的氨基酸序列相比，有至多3个，更佳地至多2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。最处的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln：his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu：val；met：ala；pheleuleu(l)ile；val；met：ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu：phe；ileleuphe(f)leu：val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetvrtyr(y)trp；phe：thr：serpheval(v)ile；leu；met：phe：alaleu本发明的肽的除皱测定法可以参考：《e贝拉尔埃斯卡等(意)，郑德芳译.用临床观察及仪器评价抗皱化妆品对皮肤缓解及光老化皮肤的有效性(英)[j].日用化学品科学，1998年第6期：24-26》(其通过引用并入本文)，由印记及图象分析测出皱纹深度。简言之，受试者连续使用测试品，每天早晚各使用1次，洁面后敷用。在实验期间停用其它除皱类化妆品。同时询问志愿者使用受试样品后自我感觉及有无过敏现象等，记录自身前后对比。测定环境：测试环境温度(约22℃，湿度约50％，并且进行实时动态监测。使用印记及图象分析测定皱纹深度，连续测试3次，取平均值。本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码本发明的肽的核酸序列。核酸可以是dna或cdna。核酸分子可以主要由编码本发明所述肽的核酸序列组成，或可以仅由编码本发明所述的肽组成。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员应理解，不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。本发明还提供了载体，所述载体中包括本发明所述的核酸序列。合适的载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述多肽的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。本领域普通技术人员应理解，在本发明中，术语“载体”包括dna分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ-噬菌体、embl噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、epstein-barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。肽的生产方法本发明的肽的生产方法可以包括如下步骤：(1)基因工程菌，例如大肠杆菌基因工程菌的构建；(2)基因工程菌的发酵培养和诱导表达；(3)肽的纯化与酶切。以大肠杆菌基因工程菌为例，在步骤(1)中的构建步骤如下：优化选择e8-n基因的dna片段，利用pcr的方法将片段进行密码子优化和拼接重组，得到完整的重组基因；将重组dna序列转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。在步骤(2)中所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和诱导表达步骤如下：(1)从lb平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于10ml的lb培养基中，220rpm，37℃培养12h-16h；(2)将菌液按照1∶100的比例接种到lb培养基中放大培养，220rmp，37℃培养3小时，待菌液的od600约为0.6时，加入终浓度为0.5mm的iptg进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。在步骤(3)中，肽的纯化步骤如下：(1)用tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；(2)利用亲和柱从上清液中纯化得到重组e8-n的融合蛋白。(3)用羟胺裂解法裂解融合蛋白，释放出游离的e8肽。(4)通过透析、反相柱等方法纯化溶液中的e8肽。本发明的实际应用效果好，将除皱短肽e8，用0.22μm滤膜进行过滤除菌后，用纯化水稀释为40μg/ml的溶液，进行人体试用后，淡纹除皱效果显著，安全无副作用，可长期使用。实施例提供以下实施例以进一步例示本发明，但是本领域技术人员应当理解这些实施例不意图限制本发明的范围，其仅由所附权利要求书限定。实施例1：pet-32a-e8-8基因表达载体的构建及表达(1)大肠杆菌基因工程菌的构建1.1.可以通过将e8多肽基因串联表达明显提高多肽表达效率，此实施例选择n＝8，也就是8重复的e8-8，其氨基酸序列为geemqrrngeemqrrngeemqrrngeemqrrngeemqrrngeemqrrngeemqrrngeemqrrn。1.2.根据e8-8的氨基酸序列，优化选择其大肠杆菌偏好的密码子基因，也就是ggtgaggaaatgcagcgccgcaatggcgaagaaatgcagcgccgcaatggcgaagagatgcaacgccgcaatggcgaggagatgcagcgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaatggcgaggagatgcaacgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaacggcgaagaaatgcaacgccgcaat(seqidno.5)，为了后续多肽酶切的需求，这个基因的5’端加入aat(羟胺酶切位点)，3’端加入taa(终止密码子)，完整的基因为aatggtgaggaaatgcagcgccgcaatggcgaagaaatgcagcgccgcaatggcgaagagatgcaacgccgcaatggcgaggagatgcagcgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaatggcgaggagatgcaacgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaacggcgaagaaatgcaacgccgcaattaa(seqidno.6)(genewiz公司合成)。1.3利用pcr的方法将此密码子优化后的基因e8-8克隆进入表达载体，这里选择常用的一种表达载体pet-32a，构建得到pet-32a-e8-8表达载体。1.4将重组表达载体pet-32a-e8-8转化入大肠杆菌表达菌株bl21(merck公司)，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。具体过程为：1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，冰上静置30min。2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。3：向该混合物中加入600μl无抗性的lb培养基(10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠)，37℃，220rpm条件下培养1h。4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的lab平板上(10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠，15g/l琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和诱导表达2.1.从lb平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌e8-8单菌落，置于10ml的lb培养基中，220rpm，37℃培养12h-16h；2.2.将菌液按照1∶100的比例接种到lb培养基中放大培养，220rmp，37℃培养3小时，待菌液的od600约为0.6时，加入终浓度为0.5mm的iptg进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。(3)重组多肽的纯化与酶切3.1用tris缓冲液(25mmtris，150mmnacl，ph7.5)重悬细菌(5g干菌/100ml)，超声破碎(超声4s，停8s，功率为100w，超声10min后停10min，并重复1～2次，直至菌液清亮不黏稠)，离心(4℃，14500g离心30分钟)收集上清液，此时表达的蛋白是his6-trx-e8-8的融合蛋白；3.2利用镍离子亲和柱(qiagen公司，货号：30210。事先用25mmtris，150mmnacl，ph7.5溶液平衡)从上清液中快速分离纯化得到his6-trx-e8-8的融合蛋白。通过20mm咪唑的tris缓冲液(20mm咪唑，25mmtris，150mmnacl，ph7.5)清洗杂蛋白约10～20个柱体积，用250mm咪唑的tris缓冲液(250mm咪唑，25mmtris，150mmnacl，ph7.5)清洗目的蛋白，大约洗脱5个柱体积可以将目的蛋白完全洗脱下来。3.3用羟胺裂解法裂解融合蛋白，释放出游离的e8短肽。将his6-trx-e8-8的融合蛋白溶液与羟胺裂解液(4m羟胺，ph9.0)按照1∶1的体积比例混合，调节到ph9.0，在45度水浴环境下封闭震荡反应，约4～6h可以反应完全。羟胺溶液可以在弱碱性环境下特异性的切割开蛋白内部的asn-gly位点，恰好可以将his6-trx-e8-8的融合蛋白中的e8多肽释放出来。通过sds-page电泳检测酶切反应进展情况。具体过程为：取蛋白液40μl，加入10μl5×的蛋白上样缓冲液(250mm的tris-hcl(ph：6.8)，10％sds，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入sds-page蛋白胶中，电压80v跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝r-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。3.4释放出的多肽e8可以通过透析方法进行进一步的纯化，然后进行质谱检测或者冻干备用。具体过程为：将多肽e8转移到1kda截留分子量的透析带中，放置到100倍透析液体积的蒸馏水溶液中，在4℃环境中透析24h，持续搅拌，可以每隔4h换一次蒸馏水。然后收集透析袋中的溶液，离心之后取上清，即为纯化后的e8多肽。3.5e8多肽的理论分子量为1019.07da，无法通过常规的sds-page进行检测，需要利用质谱方法进行鉴定。如图3所述，根据质谱方法鉴定，本发明的m11的多肽的实际分子量为1019da，与理论分子量一致。我们通过与上文类似的表达和制备方式未能实现argireline多肽的生成。实施例2：除皱短肽e8的人体试用将除皱短肽e8用0.22μm滤膜过滤除菌，用纯净水稀释成40μg/ml，存放冰箱待用。40名志愿者(男性20名，女性20名，年龄为30-45岁)随机分为a、b两组，各20名(男性10名，女性10名)，a组志愿者于面部法令纹、眼纹、唇纹等皱纹处试用7ml40μg/ml的除皱短肽e8，均匀涂抹完毕后，可明显观察到皱纹变浅；b组志愿者于面部法令纹、眼纹、唇纹等皱纹处试用7ml纯净水，在实验前测皱纹深度，并在实验期间停用其他除皱类化妆品，连续使用15天后测皱纹的深度。方法参考：《e贝拉尔埃斯卡等(意)，郑德芳译.用临床观察及仪器评价抗皱化妆品对皮肤缓解及光老化皮肤的有效性(英)[j].日用化学品科学，1998年第6期：24-26》(其通过引用并入本文)，由印记及图象分析测出皱纹深度。简言之，受试者连续使用测试品，每天早晚各使用1次，洁面后敷用。在实验期间停用其它除皱类化妆品。同时询问志愿者使用受试样品后自我感觉及有无过敏现象等，记录自身前后对比。测定环境：测试环境温度(约22℃，湿度约50％，并且进行实时动态监测。使用印记及图象分析测定皱纹深度，这些印记用电视摄像机连接计算机和图像分析软件进行定量，从而能够定量得到单位表面积上皱纹的数目以及深度(μm)。连续测试3次，取平均值。图4显示了涂抹除皱短肽e8或纯净水后皱纹深度的对比情况，证明了涂抹除皱短肽e8后皱纹深度明显比涂抹前及涂抹纯净水的低。此外，a组志愿者均表示感觉良好且无过敏现象，并且主观认为与使用除皱短肽e8前相比皱纹更淡，淡纹、除皱效果显著，无副作用。相比之下，b组志愿者认为与使用前相比无变化。序列表<110>山西锦波生物医药股份有限公司<120>肽及其制备方法和用途<130>c18p2077<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>e8<400>1glygluglumetglnargargasn15<210>2<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>e8-2<400>2glygluglumetglnargargasnglygluglumetglnargargasn151015<210>3<211>24<212>prt<213>人工序列<220><223>e8-3<400>3glygluglumetglnargargasnglygluglumetglnargargasn151015glygluglumetglnargargasn20<210>4<211>32<212>prt<213>人工序列<220><223>e8-4<400>4glygluglumetglnargargasnglygluglumetglnargargasn151015glygluglumetglnargargasnglygluglumetglnargargasn202530<210>5<211>192<212>dna<213>人工序列<220><223>e8-8编码序列<400>5ggtgaggaaatgcagcgccgcaatggcgaagaaatgcagcgccgcaatggcgaagagatg60caacgccgcaatggcgaggagatgcagcgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaat120ggcgaggagatgcaacgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaacggcgaagaaatg180caacgccgcaat192<210>6<211>198<212>dna<213>人工序列<220><223>具有羟胺酶切位点和终止密码子的<400>6aatggtgaggaaatgcagcgccgcaatggcgaagaaatgcagcgccgcaatggcgaagag60atgcaacgccgcaatggcgaggagatgcagcgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgc120aatggcgaggagatgcaacgccgcaatggcgaggaaatgcagcgccgcaacggcgaagaa180atgcaacgccgcaattaa198当前第1页12