一种检测珊瑚白化病原溶藻弧菌XSBZ03和XSBZ14的引物对、试剂盒和检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测珊瑚白化病原溶藻弧菌的引物对、试剂盒及其检测方法，更具体地说，本发明涉及一种用于同时快速检测珊瑚病原菌株珊瑚白化病原溶藻弧菌xsbz03和xsbz14的引物对、试剂盒及其检测方法。

背景技术

珊瑚礁为海洋中一类极为特殊的生态系统，保持有较高的生物多样性和初级生产力，被誉为海洋中的热带雨林”、“蓝色沙漠中的绿洲”，一直以来都是重要的生命支持系统。然而，细菌性病原引起的珊瑚疾病频发，导致珊瑚礁生态系统结构不断瓦解，现已有三分之二的珊瑚礁处于灭绝的危险之中。

溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)菌株xsbz03和xsbz14引起的扁枝滨珊瑚白化综合症对南中国海的珊瑚礁生态系统构成严重威胁。为应对该病原对我国海域珊瑚的危害，首先需要对xsbz03和xsbz14进行准确诊断，因此，建立珊瑚病原菌株xsbz03和xsbz14的快速检测方法就显得尤为重要，它是开展我国珊瑚疾病诊断的首要前提，也是阐明该病原流行规律、转移机制和致病机理的重要基础，还是评估该病原对南中国海珊瑚危害程度和制定相应疾病控制措施的必由之路。

基于上述理由，特提出本申请。

技术实现要素：

本发明针对背景技术中所指出的问题及现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于同时快速检测珊瑚白化病原溶藻弧菌xsbz03和xsbz14的引物对及其试剂盒和检测方法。

本发明的第一个目的在于提供一种同时快速检测珊瑚白化病原溶藻弧菌xsbz03和xsbz14的pcr检测用引物对，其特异性强，能够将该珊瑚病原菌株xsbz03和xsbz14与其他常见海洋菌株进行区分。

为实现上述第一个目的，本发明的技术方案为：

上述用于同时快速检测xsbz03和xsbz14菌株的引物对包括上游引物f1和下游引物r1，所述上游引物f1的序列如seqidno：1所示，下游引物r1的序列如seqidno：2所示。

本发明设计的强特异性引物是实现所述目的的关键因素，本发明申请人通过生物信息学分析和大量的实验，才筛选到了本发明pcr检测的靶基因genbank登录号为：mh702378，并根据该靶基因设计了上述所述的引物对f1/r1。使用该引物对39株珊瑚白化病原溶藻弧菌，16株哈维氏弧菌(vibrioharveyi)，3株副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)，1株轮虫弧菌(vibriorotiferianus)，1株需钠弧菌(vibrionatriegens)，1株创伤弧菌(vibriovulnificus)，超纯水进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，发现仅有xsbz03和xsbz14可产生扩增产物。

本发明的第二个目的在于提供一种用于同时快速检测珊瑚白化病原溶藻弧菌xsbz03和xsbz14的试剂盒，所述试剂盒是基于上述引物对制成的pcr检测试剂盒，其特异性强、敏感性高、检测准确、耗时短、有效。

为实现上述第二个目的，本发明的技术方案为：

上述所述试剂盒包括：上游引物f1、下游引物r1，2×pcrmastermix，超纯水，阳性对照，阴性对照。

作为优选的方案，上游引物f1、下游引物r1各2.0μl、2×pcrmastermix25μl、超纯水17μl、阳性对照，阴性对照各一支。

作为优选的方案，所述2×pcrmastermix由3mmol/lmgcl2，100mmol/lkcl，各500μmol/ldntp，20mmol/ltris-hcl(ph8.3)及0.4u/μlacetaqdnapolymerase聚合酶组成。

作为优选的方案，所述阳性对照为xsbz03和xsbz14的混合灭活冻干粉或xsbz03和xsbz14的混合pcr产物。

所述阴性对照为超纯水。

本发明的第三个目的在于提供一种用于同时快速检测珊瑚白化病原溶藻弧菌xsbz03和xsbz14的检测方法，所述方法是基于上述所述xsbz03和xsbz14的pcr检测试剂盒的检测方法，其操作简单，pcr耗时较短且准确度高。

为实现本发明的第三个目的，本发明的技术方案为：

一种用于同时快速检测珊瑚白化病原溶藻弧菌xsbz03和xsbz14的检测方法，所述方法包括以下步骤：

1)pcr模板：提取待检样品dna，或者直接使用菌液作为模板；

2)基因扩增：将步骤1)提取的dna以及阳性对照加入到检测试剂盒中进行pcr扩增；

3)检测：对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

作为优选的方案，步骤1)中所述待检样品为细菌纯培养物或环境水样。

作为优选的方案，pcr扩增采用的试剂盒包括超纯水17μl、2×pcrmastermix25μl、上，下游引物各2.0μl、待检测样品dna4.0μl。

作为优选的方案，步骤2)所述pcr扩增过程具体包括：

94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min。

与现有技术相比，本发明提供的用于检测xsbz03和xsbz14的引物对或试剂盒具有以下有益效果：

(1)基层常规疫病诊断实验室的仪器、条件可满足检测需求；(2)该引物对可同时扩增xsbz03和xsbz14两株菌，并可将它们与其他近缘菌株进行区分，(3)本发明试剂盒检测灵敏度高，对xsbz03的基因组检测极限170fg/μl，对xsbz03细菌的检测极限6.4×10³cfu/ml；对xsbz14的基因组检测极限20fg/μl，对xsbz14细菌的检测极限8.5×10²cfu/ml；(4)本发明的试剂盒可同时快速检测珊瑚白化病原溶藻弧菌xsbz03和xsbz14，其特异性强、敏感性高、检测准确、耗时短、有效，对由xsbz03和xsbz14引起的珊瑚白化的疾病诊断有较高的准确性，本方法的建立可以评估这两株病原对我国海域珊瑚的危害程度并对制定该疾病的控制措施提供指导意义。

附图说明

图1为特异性评价实验中的凝胶电泳图：其中m泳道是dnamarkerdl500bp分子量标准；1，2泳道分别为xsbz03和xsbz14，编号3-32分别为溶藻弧菌hn07014，溶藻弧菌hn07011，溶藻弧菌hn08809，溶藻弧菌hn08304，溶藻弧菌hn08307，溶藻弧菌hn08805，溶藻弧菌hn07005，溶藻弧菌xse381，溶藻弧菌hn08803，溶藻弧菌hn08810，溶藻弧菌30031，溶藻弧菌hn08203，溶藻弧菌hn07006，溶藻弧菌hn08811，溶藻弧菌hn08155，溶藻弧菌hn07002，溶藻弧菌tg06003，溶藻弧菌hn08306，溶藻弧菌hn07009，溶藻弧菌hn08813，溶藻弧菌e001，溶藻弧菌hn08335，溶藻弧菌hn08303，溶藻弧菌hn08801，溶藻弧菌hn08201，溶藻弧菌e167，溶藻弧菌hn08305，溶藻弧菌hn08156，溶藻弧菌atcc17749，溶藻弧菌hn07010，33-62泳道溶藻弧菌hn13001，溶藻弧菌pbvay40119，溶藻弧菌hn08202，溶藻弧菌pbvay41120，溶藻弧菌pbvay38117，溶藻弧菌pbvay12023，溶藻弧菌pbvay42121，哈维氏弧菌ns131241，哈维氏弧菌ns131751，哈维氏弧菌ns131251，哈维氏弧菌ns131651，哈维氏弧菌ns131451，哈维氏弧菌ns131632，哈维氏弧菌ns131631，哈维氏弧菌wc13d121，哈维氏弧菌hnh11011，哈维氏弧菌hnh11001，哈维氏弧菌wc13dh21，哈维氏弧菌wc13h252，哈维氏弧菌hnh11009，哈维氏弧菌hnh11013，哈维氏弧菌wc13dh52，哈维氏弧菌pbvh78461，副溶血弧菌pbvpy07150，副溶血弧菌pbvpy06106，副溶血弧菌atcc17802，轮虫弧菌hn076，创伤弧菌标准atcc27562，需钠弧菌atcc33788，超纯水。

图2为灵敏性评价实验中的xsbz03基因组浓度凝胶电泳图，泳道m:dnamarkerdl500bp分子量标准，泳道1-7：模板中xsbz03的dna浓度分别为1.7ng/μl，170pg/μl，17pg/μl，1.7pg/μl，170fg/μl，17fg/μl，1.7fg/μl，泳道8：超纯水。

图3为灵敏性评价实验中的xsbz14基因组浓度凝胶电泳图，泳道m:dnamarkerdl500bp分子量标准泳道1-7：模板中xsbz03的dna浓度分别为2.0ng/μl，200pg/μl，20pg/μl，2.0pg/μl，200fg/μl，20fg/μl，2.0fg/μl。

图4为灵敏性评价实验中的xsbz03细菌浓度凝胶电泳图，泳道m：dnamarkerdl500bp分子量标准，泳道1-8：模板中xsbz03的细菌浓度分别为6.4×10⁷cfu/ml，6.4×10⁶cfu/ml，6.4×10⁵cfu/ml，6.4×10⁴cfu/ml，6.4×10³cfu/ml，6.4×10²cfu/ml，6.4×10cfu/ml，6.4cfu/ml。

图5为灵敏性评价实验中的xsbz14细菌浓度凝胶电泳图，泳道m:dnamarkerdl500bp分子量标准，泳道1-8：模板中xsbz03的细菌浓度分别为8.5×10⁷cfu/ml，8.5×10⁶cfu/ml，8.5×10⁵cfu/m，8.5×10⁴cfu/ml，8.5×10³cfu/ml，8.5×10²cfu/ml，8.5×10cfu/ml，8.5cfu/ml。

具体实施方式

下面结合实施案例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

实施例1

1、引物设计

为了将珊瑚病原菌株xsbz03和xsbz14和其他近缘菌株区分开来，从而提高该疾病诊断的准确性，本发明申请人通过生物信息学分析和大量的实验，才筛选到了本发明pcr检测的靶基因，并根据该靶基因设计了一对合适的引物，该靶基因genbank登录号为：mh702378，为溶藻弧菌xsbz14全基因组中的一段序列，根据该序列设计的引物可扩增xsbz03和xsbz14，而对本申请中提及的其他菌株无扩增效果。

引物f1(seqidno：1):5'-gcgcactcaaaaaacctatcaa-3'，

引物r1(seqidno：2):5'-gcaccagtctcaccacgc-3'。

2、模板准备

将xsbz03和xsbz14等弧菌在tcbs培养基中分离纯化，然后在2216e培养基中37℃下培养12h，采用takara的细菌基因组提取试剂盒(takaraminibestbacteriagenomicdnaextractionkitver.3.0)提取细菌dna，-20℃保存备用。

3、pcr扩增

将上述提取的dna模板用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系为50μl，反应体系见表2。

表2pcr反应体系表

pcr反应参数为：

94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃15s，35个循环；72℃5min。

依据下述判断标准确定样品中是否含xsbz03或xsbz14：取6μl上述pcr扩增产物，经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下进行观察，当pcr扩增产物电泳后仅出现一条特异性条带，且该条带大小约为122bp，则待检测样品为xsbz03或xsbz14。阴性对照无pcr扩增条带，阳性对照应仅出现一条大小约为122bp的特异性条带。

实施例2

检测试剂盒的灵敏性试验

xsbz03基因组检测极限(图2)：按照实施例1标题2的方法，提取dna，使用核酸为了测定仪测定其浓度，xsbz03基因组初始浓度为17ng/μl，利用超纯水进行十倍梯度稀释，共稀释7个梯度，分别为1.7ng/μl(泳道1)，170pg/μl(泳道2)，17pg/μl(泳道3)，1.7pg/μl(泳道4)，170fg/μl(泳道5)，17fg/μl(泳道6)，1.7fg/μl(泳道7)，超纯水(泳道8)，dnamarker500(泳道9)结果显示，该引物对xsbz03基因组检测极限为170fg/μl。

xsbz14基因组检测极限(图3)：xsbz14初始浓度为20ng/μl，使利用超纯水进行十倍梯度稀释，共稀释7个梯度，2ng/μl(泳道1)，200pg/μl(泳道2)，20pg/μl(泳道3)，2pg/μl(泳道4)，200fg/μl(泳道5)，20fg/μl(泳道6)，2fg/μl(泳道7)。超纯水(泳道8)，dnamarker500(泳道9)。结果显示，该引物对xsbz14基因组检测极限为20fg/μl。

xsbz03菌液检测极限(图4)：利用pbs缓冲液十倍稀释并结合平板涂布对初始菌液浓度进行测定，结果显示xsbz03菌液初始浓度为6.4×10⁸cfu/ml，取7个稀释梯度，6.4×10⁷cfu/ml(泳道1)，6.4×10⁶cfu/ml(泳道2)，6.4×10⁵cfu/ml(泳道3)，6.4×10⁴cfu/ml(泳道4)，6.4×10³cfu/ml(泳道5)，6.4×10²cfu/ml(泳道6)，64cfu/ml(泳道7)超纯水(泳道8)，dnamarker500(泳道9)。结果显示，该引物对xsbz03菌液检测极限为6.4×10³cfu/ml。

xsbz14菌液检测极限(图5)：利用pbs缓冲液十倍稀释并结合平板涂布对测定初始菌液浓度测定，结果显示，xsbz14菌液初始浓度为8.5×10⁸cfu/ml，取7个稀释梯度，8.5×10⁷cfu/ml，8.5×10⁷cfu/ml，8.5×10⁶cfu/ml，8.5×10⁵cfu/ml，8.5×10⁴cfu/ml，8.5×10³cfu/ml，8.5×10²cfu/ml，85cfu/ml，结果显示，该引物对xsbz03菌液检测极限为8.5×10²cfu/ml。

参考实例1和实例2，说明该试剂盒对珊瑚病原菌株xsbz03和xsbz14的检测具有高的特异性和灵敏性。

序列表

<110>海南大学

<120>一种检测珊瑚白化病原溶藻弧菌xsbz03和xsbz14的引物对、试剂盒和检测方法

<130>无

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcgcactcaaaaaacctatcaa22

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcaccagtctcaccacgc18

<210>3

<211>1632

<212>dna

<213>溶藻弧菌xsbz14(vibrioalginolyticus)

<400>3

atgcgttcagctaaccatagcgaacttagcaacgccctacttgcgatcagtcaatctttg60

gctgatcgcagccagcttacccaaaccttggatgctgtgttgaccgctgcgagacaaatg120

accctcgcaaagcacggcatcatttatgttttggaccagactggtcaggcgttgattcca180

agtaccgctcaccataacgataaaacgattgtttcccacccttgggaggcattgcagatt240

gattccgcaagtgagaacgacccatttaactttgccattcgcaatggtgaagtggtattg300

attaacgagttgtataagtacaacggctatgactgtgacagcatctatcaaactgagcag360

acgctaggactaaaaagcgagaacttgctggcttggcctttgattgatagcgaaagtaag420

accattggactcttggtcttgctcgatttaagtgttatcgacaatgaggctgcattgact480

gagttttgtcgcatggccgcaagtaatattcgccaagctgtttggttagagcaatacggg540

caagtgattaaaagcctcagtgccgataatcaagccctcgttcgtgagaatacgcaactc600

aaaaagcgcactcaaaaaacctatcaaggccctattgcagagagcgaagaaatgctcaat660

gtcttgaatcgtcttgataaagtgctgtctcttcctgtcgacgttctgttgcgtggtgag720

actggtgccggtaaagaggtgatcgcgaaatacattcacgaaaactctaaccgttcagaa780

cagcctttgatcgtacaaaactgtgcggcaattcccgaacagttgttagagtctgaactg840

tttgggcataagaaaggttcattcacgggcgcggacaaagacaaagtcggtttgtttgaa900

gcagccaacggcggcacgcttttcctagatgaaattggcgatatgccaatgctactacaa960

gcgaagttactgcgtgtactgcaagagcgtaaagttcgccctatcggtaccagcaaagag1020

attgaagtggacgtgcgcgttatcgctgcaacccactgtaatcttatgcagcaaatcaaa1080

gatggcggattccgtgccgacttgttctatcgcttaaatgtcttccctattacattgccg1140

cccctgagagcccgtaagtcggacattattccccttgctgaacatttcgtgcaacacaca1200

accaacacgctaggtttgccgcaagcgccagggttaagtgccaatgtacgtaaacagctg1260

cttgcctaccaatacccagggaacgtgcgtgagcttaaaaacatcatcgagcgctcggta1320

ctactgtccgattttgaaaccattactcacattgagtttggcgaacaaatcccagaagat1380

gtaccaagtatcgacatgaaagcagcttcacctaccccagagcaacctgcttacgagcag1440

caagcacaagcggatttagaagacgtttcaaagagccttaaagacgtcgttagccaatac1500

gagcgtacagtaatcatcgattgcttaaatgcctgcaattggcacaccaagaaggccgcc1560

gagcaattggcacttccaatgagcactctcaaccataagatgaagaaatacgatatttct1620

gcagcgggttga1632