一株高效硫氧化菌在含硫化黑废水处理中的应用的制作方法

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，涉及一株硫化黑氧化脱硫降解菌的筛选方法及其在含有硫化黑摇瓶培养体系中脱硫条件的优化。

背景技术：

社会的不断发展，推动着化学工业的发展，但在发展过程中工业废水也在不断地增加。染料废水是主要的有害工业废水之一，主要来源于染料及染料中间体生产行业，由各种产品和中间体结晶的母液、生产过程中流失的物料及冲刷地面的污水等组成。我国是纺织大国，纺织产业对我国国计民生发挥着巨大作用。同时，纺织产业又是重污染行业，尤其是印染废水的排放量已跃居全国工业企业废水排放量的前4位。每印染加工1t纺织品耗水100～200t，其中80％～90％成为废水。随着染料工业的不断壮大，其生产废水已成为主要的水体污染源。根据美国c.i.(colorindex)，目前染料已有数万种之多。我国是染料生产大国，纺织染料工业近年来快速发展，目前我国各种染料产量已达90万吨，染料产量占世界的60％左右。

染料废水对环境有很大的影响。染料废水中含有多种具有生物毒性或三致性能的有机物，难以采用常规处理方法进行治理。尤其是废水中残存的染料组分即使浓度很低，排入水体也会造成水体透光率降低，导致水体生态系统的破坏。染料的降解产物多为联苯胺等一些致癌的芳香类化合物，医学科学已证明：80％～90％的癌症与环境因子有关，而已发现的致癌物中十之八、九是有毒有机化合物。德国在发现部分以芳香胺为基础的偶氮染料用于印染织物会对人体产生不利影响后已禁止使用和进口这些偶氮染料，印度也在准备禁止类似偶氮染料的生产和使用。

硫化染料的发现与应用已有一百多年的历史，是一类水不溶性染料。其生产工艺比较简短，成本低廉，使用方便，而且具有良好的水洗牢度和日晒牢度，所以硫化染料的需求相当大。但其上色率不高，只有30％，其他均残留在水中，形成废水中污染物浓度较高。硫化黑，又称硫化青，呈黑色鳞片状固体，主要用于棉纺织品染色。硫化黑染料是含硫较多的高分子化合物，它的结构中含有二硫键及多硫键，而且很不稳定，特别是多硫键在一定温度、湿度条件下能被空气中的氧氧化为硫的氧化物，并进一步与空气中的水分子作用生成硫酸。我国生产的硫化黑染料是用2,4-二硝基苯酚和多硫化钠在水溶液中煮沸而成，这种硫化黑染料是我国产量最大的染料，其主要结构尚未能够加以肯定，有学者认为当硫化温度高于110℃时，所生成的染料结构式如图1所示。

技术实现要素：

本发明拟解决的技术问题是解决现有的牛仔布印染废水处理时染料硫化黑无法降解，沉积在活性污泥中，在后续活性污泥干燥用于焚烧发电时由于含有大量硫而造成so2超标排放的问题，目的是提供一株高效脱硫微生物菌株acinetobactersp.ds-9并通过降解条件的优化提高其脱硫效果。

为实现上述目的，本发明提供一种硫化黑脱硫微生物，其分类命名为不动杆菌(acinetobactersp.)ds-9，于2018年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16191。所述不动杆菌(acinetobactersp.)ds-9能以染料硫化黑为唯一碳源、硫源。

本发明所获得菌株筛选自郊区农田土壤，经过含染料硫化黑的富集培养基富集培养，再以含硫化黑为唯一碳源、硫源的无机盐筛选培养基分离纯化，得到35株形态各异的脱硫菌株，通过96孔板快速初筛，得到10株硫化黑氧化脱硫微生物菌株，再经过摇瓶复筛，得到1株高效硫氧化微生物菌株ds-9。

本发明还提供上述硫化黑氧化脱硫菌acinetobactersp.ds-9在含有硫化黑的无机盐培养基中的脱硫能力的优化方法。通过额外补充碳源及表面活性剂，可提高上述菌株的脱硫能力，并通过单因素试验和正交试验优化方法获得最优脱硫降解条件。

与现有技术相比，本发明具有以下显著有点：

本发明采用微生物处理技术来对染料硫化黑进行生物脱硫，目前针对硫化黑的处理方法主要集中在物理化学方法，这些方法对设备要求高、费用昂贵、人员素质要求较高等缺点，不适宜大规模工厂化处理染料硫化黑印染废水，且本发明有目的的将硫化黑染料中大量存在的硫元素进行氧化，使其结构中的硫被氧化成硫酸根存在水中进行后续处理，而活性污泥中沉积的硫化黑不含有大量硫元素，在污泥干燥后可有偿出售于火力发电厂用于焚烧发电时不会造成so2超标排放的问题，不仅节省了企业处理废水时的费用，还增加了企业受益。

附图说明

图1为染料硫化黑结构式；

图2为不动杆菌(acinetobactersp.)ds-9扫描电镜(sem)图；

图3为不动杆菌(acinetobactersp.)ds-9系统发育树图；

图4为ds-9在初始无机盐培养基中连续7天so4^2-及ph变化曲线图；

图5为外加碳源对脱硫效果及终ph的影响；

图6为外加氮源对脱硫效果及终ph的影响；

图7为外加tween80对脱硫效果及终ph的影响；

图8为ds-9在优化培养基中连续7天so4^2-及ph变化曲线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明，这些实施例仅用出于解释说明的目的，并不对本发明做任何形式的限定。本发明采用的试剂均为市售分析纯及以上，粉末状硫化黑染料由江苏省常州市黑牡丹(集团)有限公司提供。

本发明中使用发酵液中so4^2-浓度的高低表示菌株脱硫能力的强弱，采用铬酸钡分光光度法测定降解体系中硫酸根含量。具体操作方法见中华人民共和国环境保护行业标准(hj/t342-2007)水质—水质硫酸盐的测定—铬酸钡分光光度法。

实施例1

不动杆菌(acinetobactersp.)ds-9的分离、筛选与鉴定

(1)菌株的分离

从江苏省常州市南郊不同农田取样点收集泥土表层下5～10cm处的土壤样品5～10g保藏于无菌20ml密封袋中，保存于4℃冰箱中用于后续菌株的筛选。从江苏省常州市黑牡丹(集团)有限公司处理印染废水的生化池取1l生化池水样及活性污泥样，保存于-20℃冰箱中用于后续菌株的筛选。各称取3～5g不同采样点的土壤样品分别加入装有50ml无菌生理盐水的250ml锥形瓶中混匀，充分振荡后静置30～60min，取上清液2～5ml加入装有50ml初始富集培养基的250ml锥形瓶中，在28～30℃条件下以120rpm·min^-1的恒温摇床培养，实现脱硫菌的富集培养。3～5天后，将5ml液体培养基转移至装有45ml新鲜的无机盐筛选培养基的250ml锥形瓶中用于随后的传代培养。用于传代培养的无机盐筛选培养基中硫化黑的浓度从50mg/l逐步提高至100mg/l。数次传代培养，取100μl菌悬液涂布与无机盐固体培养基上，待长出菌落后挑选表型各不相同的菌落在无机盐固体平板培养基上进行划线分离，分离出表型各不相同的单菌落，将所有获得的菌落进行多次划线分离以获得纯种菌株，共计35株。将分离得到的35株菌株进行斜面及冻存管保存。

初始富集培养基的组成如下：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，硫化黑50mg/l。无机盐筛选培养基(msm)的组成如下：k2hpo44g/l，kh2po44g/l，nh4cl0.4g/l，盐溶液10ml/l，硫化黑浓度逐步从50mg/l提升至100mg/l，无机盐固体培养基则再加入1.5～2％琼脂粉。盐溶液的组成如下：mgcl215g/l，mncl24g/l，fecl35g/l，cacl20.3g/l。

(2)菌株的筛选

使用96孔板快速初筛选方法和摇瓶复筛相结合的方法。挑取分离所得到的35株单菌落，分别接种于装有无机盐筛选培养基的96孔板中，在28℃恒温摇床中以160rpm·min^-1培养3～5天，在波长600nm下测发酵液的吸光度，分别挑选出菌浓较高的(ds-9、ds-31、ds-23、ds-27)和较低的(ds-4、ds-24、ds-11、ds-1)菌株各4株及2株霉菌(ds-2、ds-28)共计10株(初筛结果见表1)进行摇瓶复筛，检测摇瓶降解体系中so4^2-含量，so4^2-含量越高说明该菌株对染料硫化黑的脱硫能力就越强，从而确定硫化黑脱硫效果最好的菌株ds-9，并进行后续鉴定及优化。

表196孔板初筛结果表

(3)菌株的鉴定

对细菌进行形态学、生理生化试验。测定菌株的16srrna基因序列与ncbi数据库中的序列进行同源性比较，最终确定该菌的种属。

形态特征：菌落不透明、表面凸起、呈乳白色、边缘整齐光滑；扫描电镜下呈短杆状，常成2个或4个分布，如图2所示。

生理生化特征：革兰氏染色呈阴性。淀粉水解试验呈阳性，过氧化氢酶试验呈阳性，明胶水解试验、甲基红试验、vp试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、h2s产生试验、氧化酶试验均呈阴性。

分子生物学鉴定：结果表明，ds-9与acinetobactersp.mo(dq848780.2)的序列相似度高达99％以上，绘制系统发育树如图3所示。

根据ds-9的形态学、生理生化试验及分子生物学分析，ds-9鉴定为不动杆菌acinetobactersp.，命名为acinetobactersp.ds-9。

本实施例说明筛选出的高效硫化黑氧化脱硫菌株ds-9为不动杆菌，在初始无机盐培养基中的脱硫能力比空白对照组提高了16％，如图4所示。

实施例2

通过额外补充碳源提高acinetobactersp.ds-9对硫化黑的脱硫效果。选择葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉三种常见的碳源和不添加碳源这四组实验作为实验组，以初始无机盐培养基不接菌作为空白对照组，每组实验做3次重复实验。具体实施操作如下：

在超净工作台中，用接种环从acinetobactersp.ds-9的保藏斜面试管中取一环菌接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期后按3～5％的接种量接入添加有相同浓度不同种类的碳源的无机盐培养基，在28℃恒温摇床中以200rpm·min^-1培养7天，取样测发酵液中so4^2-含量及终ph，结果如图5所示。

本实施例说明，当加入碳源后，ds-9的脱硫能力均有提升，加入可溶性淀粉的实验组提高的最多，未接菌的空白对照组中硫酸根浓度为1720mg/l，加入可溶性淀粉的实验组中硫酸根浓度为2318mg/l，提高了35％，从而确定外加碳源可溶性淀粉可调高ds-9的脱硫能力。

实施例3

通过额外补充氮源提高acinetobactersp.ds-9对硫化黑的脱硫效果。本实验在设计之初就已在初始无机盐培养基中加入氮源nh4cl，故而再选择nh4hco3、蛋白胨、酵母粉三种氮源和不添加氮源五组作为实验组，以初始无机盐培养基不接菌作为空白对照组，每组实验做3次重复实验。具体实施操作如下：

在超净工作台中，用接种环从acinetobactersp.ds-9的保藏斜面试管中取一环菌接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期后按3～5％的接种量接入添加有相同浓度不同种类的氮源的无机盐培养基，在28℃恒温摇床中以200rpm·min^-1培养7天，取样测发酵液中so4^2-含量及终ph，结果如图6所示。

本实施例说明，当加入氮源后，ds-9的脱硫能力有不同程度的提升，加入nh4cl的实验组提高的最多，未接菌的空白对照组中硫酸根浓度为1830mg/l，加入nh4cl的实验组中硫酸根浓度为2368mg/l，提高了29％，从而确定nh4cl为最适氮源。

实施例4

通过额外补充表面活性剂提高acinetobactersp.ds-9对硫化黑的脱硫效果。查阅生物脱硫的国内外文献，发现在二苯并噻吩的生物脱硫研究中，通过向降解体系中添加表面活性剂tween80可提高生物脱硫效果，故而本实验中向硫化黑降解体系中添加tween80观察其是否能提高ds-9的脱硫效果。具体实施操作如下：

在超净工作台中，用接种环从acinetobactersp.ds-9的保藏斜面试管中取一环菌接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期后按3～5％的接种量接入添加tween80和未添加tween80的无机盐培养基，在28℃恒温摇床中以200rpm·min^-1培养7天，取样测发酵液中so4^2-含量及终ph，结果如图7所示。

本实施例说明，当加入tween80后，ds-9的脱硫能力有明显提升，未接菌的空白对照组中硫酸根浓度为1856mg/l，加入tween80的实验组中硫酸根浓度为2453mg/l，提高了32％，从而确定tween80对ds-9的脱硫能力有较好的提升效果。

实施例5

通过实施例2、3、4的单因素试验，结合对脱硫效果有影响的接种量、温度、转速、初始ph四个因素进行7因素3水平的正交设计试验，正交试验的具体因素水平见表1。根据正交设计助手软件设计的正交表进行试验，试验结果见表2。

表2正交试验因素水平表

表3正交试验结果表

本实施例说明，影响ds-9脱硫效果的因素从主到次分别为：接种量，nh4cl，转速，可溶性淀粉，温度，初始ph，tween80。菌株ds-9的最佳降解条件为接种量5％，nh4cl400mg/l，转速200rpm·min^-1，可溶性淀粉500mg/l，温度28℃，初始ph7.2，tween807g/l。选用最佳降解条件进行ds-9脱硫能力的验证试验，连续7天测降解体系中的so4^2-含量及ph，绘制硫酸根含量及ph随时间的变化曲线图，如图8所示，当发酵第4天时，未接菌的空白对照组中硫酸根浓度为1824mg/l，最佳降解体系中的硫酸根含量为2773mg/l，提高了52％，达到最终脱硫条件的优化目标。