一种丝素蛋白光固化水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及水凝胶材料
技术领域：
，特别涉及一种通过紫外光固化的新型丝素蛋白水凝胶及其制备方法。
背景技术：
：蚕丝，是熟蚕结茧时分泌丝液凝固而成的连续长纤维。丝素是一种源于蚕丝的天然高分子蛋白质，其含量占蚕丝的70%～80%，含有18种氨基酸，其中的11种为人体必需氨基酸；另一方面，丝素蛋白对人体无毒害作用，安全可靠，具有良好的生物相容性，适于开发成功能性材料。因此，随着对其独特氨基酸组成及结晶结构等理化特性研究的深入，国内外对丝素的应用正从传统的纺织领域积极向多领域探索，丝素蛋白在生物医学材料领域的应用也日趋广泛和深入。n-乙烯基吡咯烷酮简称nvp，它在医药、食品、化妆品、粘合剂、涂料等方面都有着广泛的用途。nvp在酸性条件下或引发剂存在下可聚合为聚乙烯基吡咯烷酮。nvp还能和其它单体（如乙酸乙烯酷、乙烯、丙烯睛、异丁烯酸醋、丙烯酸异丙烯醋等）共聚而得到共聚物。nvp聚合形成聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)简称pvp，是一种非离子型高分子化合物。pvp作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性质，胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用，但其最具特色，因而受到人们重视的是其优异的溶解性能及生理相容性。pvp有优良的生理惰性，不参与人体新陈代谢，又具有优良的生物相容性，对皮肤、粘膜、眼等不形成任何刺激。医药级pvp为国际倡导的三大药用新辅料之一，可用做片剂、颗粒剂的粘结剂、注射剂的助溶剂、胶囊的助流剂；眼药的去毒剂，延效剂，润滑剂和包衣成膜剂，液体制剂的分散剂和酶及热敏药物的稳定剂，还可用做低温保存剂。因此，pvp能够用于生物材料，但是其水溶性限制了作为植入材料的应用范围。紫外光固化一般需要加入光敏剂，而光敏剂残留有可能造成毒性。中国发明专利（cn107118359a）采用生物光敏剂核黄素光催化形成丝素蛋白水凝胶，但是光敏剂核黄素的残留有可能造成透明度的下降。中国发明专利（cn105294955a）公开了一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶及其制备方法，以具有光固化性能的改性高分子材料为原料制备而成，但得到的水凝胶弹性模量较差。中国发明专利（cn106009709a）公开了一种丝素蛋白互穿网络水凝胶及其制备方法，通过辣根过氧化物酶和过氧化氢催化n-乙烯基吡咯烷酮单体发生聚合反应，生成聚乙烯吡咯烷酮并与丝素蛋白大分子发生分子链缠结，在一定条件下形成以无规卷曲结构为主的互穿网络（ipn）水凝胶。该丝素蛋白水凝胶材料具有高强度、弹性和透明度。但制备得到的丝素蛋白水凝胶材料因为加入了过氧化氢，可能具有一定的细胞毒性，对细胞相容性的研究产生了一定的影响。技术实现要素：本发明针对现有技术存在的不足，提供一种透光性好，降解性能优良的丝素蛋白光固化水凝胶及其制备方法。实现本发明目的的技术方案是提供一种丝素蛋白光固化水凝胶的制备方法，以家蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析处理，得到丝素蛋白水溶液，再包括以下步骤：(1)配置浓度为1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液；(2)调节丝素蛋白水溶液的浓度为10g/l～100g/l；(3)在丝素蛋白水溶液中分别加入n-乙烯基吡咯烷酮和辣根过氧化物酶水溶液，n-乙烯基吡咯烷酮的终浓度为20g/l～100g/，辣根过氧化物酶的终浓度为10unit/ml～50unit/ml，混合均匀后得到复合溶液；(4)将复合溶液倒入可透过紫外光的透明模具中，向复合溶液中通入氧气，保持复合溶液中氧气分压处于饱和状态；（5）在室温、紫外光照射条件下处理5min～40min，得到一种丝素蛋白光固化水凝胶。步骤（4）模具中复合溶液的厚度为5毫米～50毫米。步骤（5）中紫外光的波长为340～400nm，强度为15mw～65mw；紫外光照射的距离为5cm～10cm。本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种丝素蛋白光固化水凝胶。本发明利用丝素蛋白与pvp两者的生物相容性，通过聚合使两者结合在一起，以获得综合两种高分子优点的水凝胶材料。同时，为了防止引发剂对于生物相容性的影响，本发明选择了光固化体系制备复合水凝胶。本发明采用单体n-乙烯基吡咯烷酮溶于丝素蛋白溶液中，通过紫外光和辣根过氧化物酶催化聚合n-乙烯基吡咯烷酮形成聚乙烯吡咯烷酮大分子与丝素蛋白分子链产生物理缠结，得到一种新型丝素蛋白水凝胶。本发明的原理是：通过天然高分子丝素蛋白以及n-乙烯基吡咯烷酮在辣根过氧化物酶作用下采用光聚合方法制备互穿网络丝素蛋白水凝胶。紫外光照下提高氧气能量，形成臭氧，超氧，过氧等高能态氧，与水反应降能形成较为稳定的过氧化氢。辣根过氧化物酶催化过氧化氢形成氢氧自由基进而引发n-乙烯吡咯烷酮发生聚合反应，生成的聚合物与丝素蛋白大分子产生物理缠结从而制备得到均匀透明的互穿网络结构水凝胶。与现有技术相比，本发明具有以下优点：1．本发明提供的sf/nvp水凝胶在制备过程中不直接加入过氧化氢，反应中间形成的微量过氧化氢迅速催化分解，没有残留，所以形成的水凝胶没有残留毒性，能够保持良好的生物相容性。2．本发明提供的sf/nvp水凝胶透过性能达到近乎100%，相对于光敏剂催化形成的sf水凝胶，sf/nvp水凝胶中没有光敏剂干扰其透光性能，而且没有光敏剂残留引起的毒性，是一种更为理想的角膜接触镜材料。附图说明图1是本发明实施例提供的n-乙烯吡咯烷酮/丝素蛋白水凝胶与纯丝素水凝胶的电镜照片对比图，其中，a为纯sf水凝胶，b为n-乙烯吡咯烷酮/丝素蛋白（sf/nvp）光固化水凝胶。具体实施方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明技术方案。实施例一（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为10g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为30g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为10unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为20毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射30min，紫外光波长为340～400nm，紫外光的照射强度为40mw，紫外光的照射距离为6cm。然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。参见附图1，它是本实施例提供的n-乙烯吡咯烷酮/丝素蛋白水凝胶与纯丝素水凝胶的电镜照片对比图，其中，a图为纯sf水凝胶，b图为sf/nvp光固化水凝胶。用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例二（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为20g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为30g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为20unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到可透过紫外光的透明模具中，使模具中溶液厚度为20毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射25min，紫外光波长为340～400nm，紫外光的照射强度为30mw，紫外光的照射距离为7cm。然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例三（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为30g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为40g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为30unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为20毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射20min，紫外光波长为340-400nm，紫外光的照射强度为60mw，紫外光的照射距离为8cm。然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例四（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为40g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为30g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为40unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为20毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射35min，紫外光波长为340-400nm，紫外光的照射强度为37mw，紫外光的照射距离为8cm。然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例五（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为50g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为30g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为50unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为20毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射38min，紫外光波长为340-400nm，紫外光的照射强度为43mw，紫外光的照射距离为8.5cm。然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例六（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为60g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为70g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为50unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为30毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射10min，紫外光波长为340-400nm，紫外光的照射强度为30mw，紫外光的照射距离为5cm。然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例七（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为70g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为30g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为50unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为40毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射30min，紫外光波长为340-400nm，紫外光的照射强度为43mw，紫外光的照射距离为7.5cm。然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例八（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为80g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为20g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为50unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为50毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射43min，紫外光波长为340-400nm，紫外光的照射强度为45mw，紫外光的照射距离为8.1cm。然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例九（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为80g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为30g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为50unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为40毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射30min，然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。实施例十（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置浓度为1000unit/ml辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白浓度为51g/l，加入n-乙烯基吡咯烷酮，使其浓度为50g/l，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为50unit/ml。（3）将上述混合均匀的复合溶液加入到紫外光透明的模具中，使模具中溶液厚度为30毫米。（4）在溶液中持续不断通入氧气，保持溶液中氧气分压处于饱和状态。（5）在室温下以紫外光照射30min，然后从模具中取出，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。（6）用打孔模具将其制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型凝胶样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表1。表1光固化水凝胶的力学性能样品压缩率（%）压缩强度（kpa）压缩率（%）压缩回弹性（%）纯丝素水凝胶5011.25013.9实施例19015.68079实施例29020.18081实施例39026.78081.2实施例49037.98087实施例59047.58086.9实施例69055.38087.8实施例79060.98093.9实施例89061.98094实施例99063.88087.6实施例109080.18080.8从表1可以看出，在压缩率为90%时，sf/nvp水凝胶的压缩强度最高可达到60kpa以上，而纯丝素水凝胶的压缩强度仅为11.2kpa，在压缩率为80%时，sf/nvp水凝胶压缩回弹性可高达93%，远远优于纯丝素水凝胶的13.9%。当前第1页12