化合物cerreninD及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用与流程

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物cerrenind及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

癌症是目前危害人类健康的主要疾病之一。国际抗癌联盟发布的数据表明，2008年，全球有1270万人患癌，死亡人数高达760万。世界范围内因癌症死亡的人数，比艾滋病、疟疾和结核病加起来还要多。如果不采取有效的措施，预计到2030年，每年将出现2600万新增癌症病例，癌症死亡人数将达1700万。我国癌症发生率正处于快速上升时期，每年癌症发病人数约260万，死亡180万。癌症已成为中国城市和农村居民的第一死因，癌症带来的经济负担和对社会发展的不良影响也日益突显。在癌症的三大疗法中，药物治疗占有主要位置。

广藿香为唇形科lamiaceae刺蕊草属pogostemon植物广藿香pogostemoncablin(blanco)benth的干燥地上部分，主要成分是广藿香酮和广藿香醇，用于湿浊中阻，脘痞呕吐，暑湿倦怠，胸闷不舒，寒湿闭暑，腹痛吐泻，鼻渊头痛。药用植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，有的内生真菌与植物生长密切相关，有的内生真菌具有合成宿主次生代谢产物的能力，已成为人类寻找新药源的热点资源。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种具有抗肿瘤活性的化合物cerrenind。

本发明的化合物cerrenind，其结构如式(i)所示：

本发明的第二个目的是提供一种化合物cerrenind的制备方法，该制备方法中所述的化合物cerrenind是从广藿香内生真菌cerrenasp.a593的发酵培养物中分离制备得到，具体包括以下步骤：

(1)制备广藿香内生真菌cerrenasp.a593的发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体干燥后粉碎用乙醇或乙醇水溶液浸提，浓缩浸提液至无乙醇，再用水悬浮，悬浮液用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩后得浸膏；

(2)将浸膏过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比30:1→1:2和二氯甲烷-甲醇以体积比5:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比1:1洗脱的馏分fr.12，馏分fr.12再经过反相c18柱，用甲醇：水按体积比60:40，70:30，80:20，90:10，100:0进行梯度洗脱，收集甲醇：水体积比70:30洗脱的馏分fr.12.8，馏分fr.12.8再经凝胶柱层析sephadexlh-20，以二氯甲烷-甲醇按体积比1:1作为洗脱剂洗脱，将收集的洗脱馏分再经半制备高效液相色谱以流动相为体积比70:30的甲醇/水，色谱柱为ymc-packods-a/aq半制备柱的色谱条件进行纯化后得到化合物cerrenind。

所述的步骤(1)制备广藿香内生真菌cerrenasp.a593的发酵培养物具体步骤为：挑取cerrenasp.a593的菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按体积分数10％的接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养7天，制得cerrenasp.a593的液体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500ml的纯化水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、维生素b110mg、用水补足至1000ml，灭菌得到。

所述的步骤(1)的乙醇水溶液为体积分数98％的乙醇水溶液。

所述的纯化是用高效液相色谱和制备薄层层析纯化。

本发明的第三个目的是提供化合物cerrenind在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物优选为抗乳腺癌的药物。

本发明通过实验发现，化合物cerrenind对乳腺癌mcf-7细胞株的ic50值为14.43μm，阳性对照物顺铂对乳腺癌mcf-7细胞株的ic50值为5.87μm。此结果表明：本发明的化合物cerrenind具有比较显著的抗肿瘤活性。

本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包含化合物cerrenind作为活性成分，所述的抗肿瘤药物优选为抗乳腺癌的药物。

本发明的第五个目的是提供广藿香内生真菌cerrenasp.a593在制备化合物cerrenind中的应用。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明从广藿香内生真菌cerrenasp.a593中制备分离得到化合物cerrenind，该化合物cerrenind具有抗肿瘤活性，可以用于制备抗肿瘤药物，为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

本发明的广藿香内生真菌cerrenasp.a593已公开于hongxinliu,haibotan,kaichen,sainili,haohuali,weiminzhang,cerreninsa-c,cerapicaneandisohirsutanesesquiterpenoidsfromendophyticfunguscerrenasp.(即该文献中的cerrenasp.菌株)。该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。

附图说明

图1是化合物1(cerrenind)的¹h-nmr谱。

图2是化合物1(cerrenind)的¹³c-nmr谱。

图3是化合物1(cerrenind)的cosy谱。

图4是化合物1(cerrenind)的hsqc谱。

图5是化合物1(cerrenind)的hmbc谱。

图6是化合物1(cerrenind)的noesy谱。

图7是化合物1(cerrenind)的hr-esims谱。

图8是化合物1的红外谱图。

图9是化合物1的紫外谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

一、广藿香内生真菌cerrenasp.a593的分离纯化和鉴定

本发明的广藿香内生真菌cerrenasp.a593是2015年1月从采自广东省阳春市的广藿香叶片中分离得到的，经its序列分析鉴定，genbank基因登录号为：ku904221，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株属于cerrena属真菌，命名为cerrenasp.a593。

二、cerrenasp.a593的液体发酵

培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：用500ml的纯化水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、维生素b110mg、用水补足至1000ml，121℃高压灭菌20min，冷却待用。

挑取适量的cerrenasp.a593的菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液；然后将种子液按体积分数10％的接种量接种于装有500ml马铃薯葡萄糖液体培养基的1000ml三角瓶中，共发酵110l，在28℃、120r/min条件下培养7天，制得cerrenasp.a593的液体发酵培养物。

三、化合物cerrenind的制备

110lcerrenasp.a593的液体发酵培养物经离心得发酵液和菌丝体。菌丝体置于55℃烘箱烘干、粉碎，用体积分数98％的乙醇水溶液冷浸提取多次至提取液基本无色，合并提取液，减压浓缩至无乙醇，加500ml水悬浮，再用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取物，在40℃下减压浓缩得浸膏37.8g。

将浸膏过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比30:1→1:2和二氯甲烷-甲醇以体积比5:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比1:1洗脱的馏分fr.12，其中得到的馏分fr.12的重量为15g，将馏分fr.12再经过反相c18柱，用甲醇：水按体积比60:40，70:30，80:20，90:10，100:0进行梯度洗脱，收集甲醇：水体积比70:30洗脱的馏分fr.12.8，馏分fr.12.8再经凝胶柱层析sephadexlh-20，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1作为洗脱剂洗脱，将收集的洗脱馏分再经半制备高效液相色谱(流动相为体积比70:30的甲醇/水，色谱柱为ymc-packods-a/aq半制备柱，流速为3ml/min)纯化后得到的化合物cerrenind(化合物1，8.9mg，保留时间为12min)。

四、化合物cerrenind的结构鉴定

¹hnmr、¹³cnmr、hmbc核磁共振谱图用brukeradvance-500核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(tms)为内标；esi-ms数据用vgautospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱用上海元析仪器有限公司uv6000紫外可见分光光度计测定。

化合物cerrenind经质谱和核磁共振波谱分析，其结构鉴定如下：

如图1-9所示，图1是化合物1(cerrenind)的¹h-nmr谱；图2是化合物1(cerrenind)的¹³c-nmr谱；图3是化合物1(cerrenind)的cosy谱；图4是化合物1(cerrenind)的hsqc谱；图5是化合物1(cerrenind)的hmbc谱；图6是化合物1(cerrenind)的noesy谱；图7是化合物1(cerrenind)的hr-esims谱；图8是化合物1的红外谱图；图9是化合物1的紫外谱图。

化合物1(cerrenind)：化合物1为黄色油状物；根据其esims准分子离子峰，确定化合物1的分子量为466；根据hresims[m+na]⁺m/z489.2423，c25h38o8na,计算值为489.2464，确定化合物的分子式为c15h12o8，不饱和度为7；

¹h-nmr谱显示有4个连氧氢质子δh5.00(d,j＝3.5hz,h-8),4.85(d,j＝11.5hz,h-1),3.97(m,h-19)和3.27(m,h-9)，6个甲基质子其中有2个连氧的甲基质子δh3.37(s,me-13)和δh3.46(s,me-14)和一系列的亚甲基质子信号。

¹³c-nmr谱显示有25个碳信号，包括3个羰基碳δc199.8(c-4),182.4(c-5),175.3(c-18)；1个环内双键δc156.9(c-6),141.8(c-7)；4个连氧碳δc81.0(c-9),80.5(c-1),71.1(c-19),70.4(c-8)；6个甲基δc57.6(c-16),56.6(c-17),27.0(c-13),31.0(c-14),24.8(c-15),14.3(c-25)，6个亚甲基δc42.4(c-11),34.7(c-20),29.9(c-21),25.8(c-12),32.5(c-23),23.2(c-24)；2个次甲基δc51.2(c-2),36.7(c-10)；2个季碳甲基δc45.1(c-3),40.2(c-12)。

通过分析1dnmr谱图，以上数据与文献报道的已知化合物pleurocybellonea(liermannjc,schüfflera,wollinskyb,birnbacherj,kolshornh,anket,opatzt.hirsutane-typesesquiterpenenswithuncommonmodificationsfromthreebasidiomycetes.j.org.chem.,2010,75:2955–2961.)结构中的片段c-1-c-7和c-10-c-25相似，表明化合物1可能是由一个五元三环体系的倍半萜和一个辛酰基碳链组成。通过谱图数据的比对，化合物1的c-1-c-7和c-10-c-25与已知化合物pleurocybellonea的c-1-c-7和c-10-c-25大致接近。唯一的不同在于，化合物pleurocybellonea的c-8和c-9位置上的双键被两个甲氧基取代。在¹h-¹hcosy谱中，次甲基质子(δh5.00,h-8)与次甲基质子(δh3.26,h-9)，次甲基质子(δh3.26,h-9)与次甲基质子(δh2.49,h-10)均有相关；在hmbc谱中，h-8与c-16,c-9和c-17均有远程相关，由此可以推断化合物1中c-8与c-9上分别连着一个甲氧基。因此，最终确定了化合物1的平面结构。

化合物1的相对构型通过noesy图谱确定。在noesy谱中，h-1/h3-14，h-9/h3-14有相关表明这些氢质子在同一朝向，并指定为α-构型。同时，h-2/h3-17，h-2/h-10，h-10/h3-13和h3-17/h3-16有相关表明位于c-8，c-9的甲氧基以及位于c-1位的辛酰基均为β-构型，从而确定了化合物1的相对构型。综上所述，化合物1为一个新的triquinane型倍半萜辛酰酯，并命名为cerrenaind。

表1cerrenind的核磁数据(δinppm,jinhz)。

^arecordedincd3cood3

经过上述方法分离的目标化合物1命名为化合物cerrenind，其结构式如式(i)所示：

实施例2

采用srb法(skehanp,storengr,dominics.newcolorimetriccytotoxicityassayforanticancer-drugscreening[j].jnatlcanceinst,1990,82:1107–1112)测试化合物cerrenind的抗肿瘤活性。

1、试验用试剂：将本发明制备的化合物cerrenind用二甲基亚砜(dmso)溶解得浓度为10mg/ml的母液，再用rpmi-1640培养基稀释至所需浓度。阳性对照为顺铂水溶液。

本实验所用肿瘤细胞株为乳腺癌细胞mcf-7。

2、实验方法：取对数生长期的mcf-7细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜rpmi-1640培养基调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，细胞接种于96孔板，每孔加入180μl的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5％co2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μl一定浓度的上述化合物cerrenind的溶液，阴性对照加20μlrpmi-1640培养基，以顺铂作阳性对照。置37℃、5％co2培养箱中培养72h后，加入50μl50％冷三氯醋酸固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的srb4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色30min，去上清，用1％冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入200μl/孔10mmol/ml的tris溶液，用酶标仪测定570nm处的吸光值(a)，用以下公式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1-a样品组/a对照组)×100％。

3、实验结果：本发明制备的化合物cerrenind对mcf-7细胞的ic50值为14.43μm，阳性对照物顺铂对mcf-7细胞的ic50值为5.87μg/ml。此结果表明：本发明的化合物cerrenind具有显著的抗肿瘤活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。