本发明涉及一种金银花中绿原酸和总黄酮的联合提取分离纯化方法，属于中药技术领域。
背景技术：
金银花因其开花初期为白色，后期又转为黄色，因而得名金银花，其因冬季不落叶又得名“忍冬”。金银花(lonicerajaponicathunb)具有悠久的用药历史，是忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或初开的花。金银花在全国很多地区种植广泛，其中山东产量最大，河南质量最优，为其道地产地。“金银花”一名始见于李时珍《本草纲目》，它性寒，味甘，入肺、心、胃经，具有清热解毒、抗炎、补虚疗风的功效，主治胀满下疾、温病发热，热毒痈疡，丹毒和肿瘤等症。金银花药用价值和保健用途广泛，社会需求量大。
研究表明金银花中的化学成分主要有：有机酸类、黄酮类、环烯醚萜苷类、三萜皂苷类、挥发油类及其他成分。金银花中的有机酸类成分迄今已分离出40多种，并且以绿原酸类为主。绿原酸是金银花的主要抗菌、抗病毒有效药理成分之一。黄酮类化合物是金银花中的活性化学成分之一，黄酮类化合物中主要包括木犀草苷、槲皮素-3-o-α-l-吡喃鼠李糖苷、异鼠李素、山奈酚-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-7-o-l-鼠李糖苷、木犀草素-3'-o-l-鼠李糖苷、芦丁等。
目前金银花的提取方法采用正交法或者响应面法优化后，一般均采用醇提，醇提存在提取剂成本高，提取剂在浓缩过程中回收的溶液的醇浓度发生改变，批量提取时每次均需要调节回收后的醇浓度，操作繁琐，醇用量大，提取成本高。
另外，金银花中绿原酸和黄酮部位的极性相似，用一般的分离纯化手段难以将二者有效分开，发表时间为2018.09.21的论文“金银花中总黄酮和绿原酸加压同步提取的工艺优化”中的提取工艺为“精密称取金银花粉末，置于高温高压反应装置内，按实验条件加压提取；提取液过滤，滤液以6000r/min高速离心分离15min，得上层清液；加入与清液等体积的乙酸乙酯，萃取5次，每次萃取时间为5min，合并萃取液，分别得到含有绿原酸的萃余物和含有总黄酮的萃取物，两者分别通过大孔吸附树脂纯化”，该论文认为，乙酸乙酯可以将绿原酸和总黄酮分离，绿原酸位于水层中，总黄酮位于乙酸乙酯层中，采用乙酸乙酯萃取即可将绿原酸和总黄酮分离，再分别对绿原酸和总黄酮进行过柱纯化即可。上述提取工艺存在以下问题：金银花中的主要黄酮类成分均为黄酮苷，黄酮苷在乙酸乙酯中和绿原酸一样溶解度小，故水层中含有绿原酸和黄酮苷，乙酸乙酯萃取并不能将绿原酸和黄酮苷分离。故论文中得到的黄酮部分得率低，金银花中的大部分黄酮没有被分离纯化得到，造成了资源的极大浪费。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种金银花中绿原酸和总黄酮的联合提取分离纯化方法，该法采用微波法预处理金银花药材后，再采用水热法-酸法提取绿原酸和总黄酮，水热法在高压反应釜体系内部创造一个高温、高压的反应环境，使水处于亚临界状态，从而使水表现出高活性、高穿透性、高传质速率的特点，酸法更能增加金银花中有效成分的溶出效率，使绿原酸和总黄酮提取完全，接着利用萃取除杂后，采用一根优选的强极性大孔吸附树脂柱分离得到绿原酸和总黄酮两个部位，分别经过进一步精制后得到绿原酸单体和总黄酮活性部位，二者提取效率均较高，使金银花药材得到充分的开发利用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种金银花中绿原酸和总黄酮的联合提取分离纯化方法，包括如下步骤：
s01，微波辅助浸润：取干燥至恒重的适量金银花药材并放入烧杯中，加入相当于金银花药材80～100倍量的去离子水，室温搅拌浸泡至少1h后，放入微波萃取机中，微波萃取温度为50～60℃，微波萃取功率为400～500w，微波萃取时间为10～30min；
s02，水热法-酸法联合提取金银花中的绿原酸和总黄酮：在s01经微波辅助浸润的烧杯中加入弱酸性缓冲溶液体系，调节浸润液的ph值为5.5～6，将烧杯中的浸润液及金银花药材倒入高压反应釜中，设定反应温度为160～200℃，反应时间为10～30min；一次提取完毕后，放出一次提取液，取相当于金银花药材干重40～60倍量的去离子水，并在去离子水中加入弱酸性缓冲溶液体系，调节去离子水的ph值为5.5～6，再将调节好ph值的去离子水加入高压反应釜中，进行二次提取，二次提取的反应温度为130～150℃，反应时间为10～15min，反应完毕后，放出二次提取液，合并一次提取液和二次提取液，离心后取上清液，上清液浓缩至金银花药材干重的2～3倍量后，停止浓缩，得提取浓缩液；
s03，醇沉：取提取浓缩液，加入纯乙醇进行醇沉，纯乙醇的加入量为提取浓缩液的3～4倍量，边加边搅拌，纯乙醇滴加完毕后，室温静置至少10h后，过滤，取滤液一，滤液一浓缩至无醇味后，再次过滤，得滤液二；
s04，萃取除杂：滤液二先用石油醚萃取至少2次，再用乙酸乙酯萃取至少2次，弃去石油醚层和乙酸乙酯层，取水层；
s05，过层析柱分离绿原酸和总黄酮：水层挥发至无有机溶剂味道后，过强极性大孔吸附树脂柱，30～40％乙醇洗脱4～6个柱体积得绿原酸有效部位，60～80％乙醇洗脱3～5个柱体积得总黄酮有效部位；
s06，绿原酸的精制：取30～40％乙醇洗脱部位，过滤后干燥，干燥品用乙醇溶解，乙醇的加入量相当于干燥品的3～5倍量，干燥品与乙醇的比例为重量体积比，滤过，滤液中加入1～2滴氨水后搅拌均匀，再逐滴加入相当于乙醇10～30倍量的乙酸乙酯，边加边搅拌，滴加完毕后将重结晶溶液置于-10～0℃的冰箱后，过夜后取出，析出结晶，过滤，结晶洗涤至中性，干燥，得绿原酸单体结晶；
s07，总黄酮的精制：取60～80％乙醇洗脱部位，过滤后浓缩，浓缩至无醇味后，在浓缩液中加入活性炭吸附颗粒，磁力搅拌至少3h后，过滤，滤液浓缩后干燥，得金银花总黄酮。
优选地，弱酸性缓冲溶液体系为nah2po4-na2hpo4混合溶液或kh2po4-k2hpo4混合溶液。
优选地，每次萃取时，石油醚和乙酸乙酯的加入量分别为滤液二体积的0.8～1.5倍量，每次萃取时振摇，每次振摇时间为至少30min，振摇后静置至少4h再分层。
优选地，强极性大孔吸附树脂柱为ads-2、d-204、xda-2中的任意一种。
优选地，干燥品在乙醇溶液中采用超声溶解，超声溶解温度为50～55℃，超声频率为5～10khz。
优选地，活性炭吸附颗粒的粒径为1～5mm。
优选地，活性炭吸附颗粒的加入量相当于银花药材干重的1～5％。
优选地，绿原酸单体结晶用丙酮保温复溶，丙酮的加入量相当于绿原酸单体结晶干重的2～3倍量，绿原酸单体结晶与丙酮的比例为重量体积比，丙酮保温的温度为50～60℃，再逐滴加入乙酸乙酯，边加边搅拌，乙酸乙酯的加入量至少为丙酮体积的40倍量，进行二次重结晶，将二次重结晶溶液放入超低温保存箱，冷藏温度为-70～-50℃，次日取出，放置于室温后，过滤，干燥，得高纯度绿原酸单体结晶。
本发明的有益效果是：
1.本发明的工艺适合金银花中绿原酸和总黄酮的联合提取、分离、纯化，并且绿原酸单体结晶纯度高达75％以上，进一步精制后可达98％以上，整个工艺的操作步骤简单易行，收率高，成本低。
2.本发明工艺过程稳定，提取剂采用安全无毒，来源广泛，价格低廉的水，并且本发明中大量使用的试剂均安全无毒，全程采用的溶剂毒性较低，对环境友好，无环境污染，适合大批量工业生产。
3.本发明首次采用水热法-酸法联合提取金银花中的绿原酸和总黄酮，水热法在高压反应釜体系内部创造一个高温、高压的反应环境，使水处于亚临界状态，从而使水表现出高活性、高穿透性、高传质速率的特点，酸法更能增加金银花中有效成分的溶出效率，使绿原酸和总黄酮提取完全。
4.本发明首次采用碱性乙醇-乙酸乙酯体系对绿原酸进行重结晶，经碱性乙醇-乙酸乙酯体系进行重结晶的绿原酸单体含量高达75％以上，该操作简单易行，重现性好，工艺稳定。
5.本发明首次采用活性炭吸附颗粒对总黄酮部位进行除杂，活性炭吸附颗粒可去除大部分非极性、弱极性有机成分，对金银花总黄酮部位的除杂针对性强，获得的总黄酮部位含量高，该总黄酮部位可用于注射用。
具体实施方式
下面对本发明作更进一步的说明。
实施例1：
一种金银花中绿原酸和总黄酮的联合提取分离纯化方法，包括如下步骤：
s01，微波辅助浸润：取干燥至恒重的适量金银花药材并放入烧杯中，加入相当于金银花药材80倍量的去离子水，室温搅拌浸泡1h后，放入微波萃取机中，微波萃取温度为50℃，微波萃取功率为400w，微波萃取时间为10min；
s02，水热法-酸法联合提取金银花中的绿原酸和总黄酮：在s01经微波辅助浸润的烧杯中加入弱酸性缓冲溶液体系，调节浸润液的ph值为5.5，将烧杯中的浸润液及金银花药材倒入高压反应釜中，设定反应温度为160℃，反应时间为10min；一次提取完毕后，放出一次提取液，取相当于金银花药材干重40倍量的去离子水，并在去离子水中加入弱酸性缓冲溶液体系，调节去离子水的ph值为5.5，再将调节好ph值的去离子水加入高压反应釜中，进行二次提取，二次提取的反应温度为130℃，反应时间为10min，反应完毕后，放出二次提取液，合并一次提取液和二次提取液，离心后取上清液，上清液浓缩至金银花药材干重的2倍量后，停止浓缩，得提取浓缩液；
s03，醇沉：取提取浓缩液，加入纯乙醇进行醇沉，纯乙醇的加入量为提取浓缩液的3倍量，边加边搅拌，纯乙醇滴加完毕后，室温静置10h后，过滤，取滤液一，滤液一浓缩至无醇味后，再次过滤，得滤液二；
s04，萃取除杂：滤液二先用石油醚萃取2次，再用乙酸乙酯萃取2次，弃去石油醚层和乙酸乙酯层，取水层；
s05，过层析柱分离绿原酸和总黄酮：水层挥发至无有机溶剂味道后，过强极性大孔吸附树脂柱，30％乙醇洗脱4个柱体积得绿原酸有效部位，60％乙醇洗脱3个柱体积得总黄酮有效部位；
s06，绿原酸的精制：取30％乙醇洗脱部位，过滤后干燥，干燥品用乙醇溶解，乙醇的加入量相当于干燥品的3倍量，干燥品与乙醇的比例为重量体积比，滤过，滤液中加入1滴氨水后搅拌均匀，再逐滴加入相当于乙醇10倍量的乙酸乙酯，边加边搅拌，滴加完毕后将重结晶溶液置于-10℃的冰箱后，过夜后取出，析出结晶，过滤，结晶洗涤至中性，干燥，得绿原酸单体结晶；
s07，总黄酮的精制：取60％乙醇洗脱部位，过滤后浓缩，浓缩至无醇味后，在浓缩液中加入活性炭吸附颗粒，磁力搅拌3h后，过滤，滤液浓缩后干燥，得金银花总黄酮。
优选地，弱酸性缓冲溶液体系为nah2po4-na2hpo4混合溶液。
优选地，每次萃取时，石油醚和乙酸乙酯的加入量分别为滤液二体积的0.8倍量，每次萃取时振摇，每次振摇时间为30min，振摇后静置4h再分层。
优选地，强极性大孔吸附树脂柱为ads-2、d-204、xda-2中的任意一种，进一步优选为ads-2。
优选地，干燥品在乙醇溶液中采用超声溶解，超声溶解温度为50℃，超声频率为5khz。
优选地，活性炭吸附颗粒的粒径为1～5mm。进一步优选地，活性炭吸附颗粒的加入量相当于银花药材干重的1％。
进一步优选地，绿原酸单体结晶用丙酮保温复溶，丙酮的加入量相当于绿原酸单体结晶干重的2倍量，绿原酸单体结晶与丙酮的比例为重量体积比，丙酮保温的温度为50℃，再逐滴加入乙酸乙酯，边加边搅拌，乙酸乙酯的加入量为丙酮体积的40倍量，进行二次重结晶，将二次重结晶溶液放入超低温保存箱，冷藏温度为-700℃，次日取出，放置于室温后，过滤，干燥，得高纯度绿原酸单体结晶。
一、绿原酸的含量测定
1.仪器和试剂：微波萃取机(xh-300a，祥鹄电脑微波超声波组合合成/萃取仪)；高压反应釜(yhgsf-50l，巩义市予华仪器有限责任公司)；分液漏斗；烧杯；数显恒温水浴锅(hh-4，常州国华电器有限公司)；抽滤漏斗；玻璃色谱柱(径高比为1：6)，恒温磁力搅拌器(df-101s，巩义市予华仪器有限责任公司)；分析天平(梅特勒-托利多)；旋转蒸发仪(re-52aa，上海亚荣生化仪器厂)；超声仪(ds-8510dt，上海生析超声仪器有限公司)；高效液相色谱仪(岛津)；冰箱(bcd-206stpq，海尔)；超低温保存箱(中科美菱)；乙醇；丙酮；乙酸乙酯；氨水；nah2po4；na2hpo4；kh2po4；k2hpo4；所用试剂均为分析纯；绿原酸标准品(购自中国食品药品检定研究院)。
2.色谱条件
色谱柱：shimadzuvp-ods(150×4.6mm，5μm)；流动相为0.4％磷酸溶液-乙腈(87∶13)；检测波长327nm；流速：1ml/min；柱温25℃。
3.绿原酸对照品溶液的配制：精密称取对照品绿原酸5mg置100ml容量瓶中，加乙醇溶解，稀释至刻度，摇匀，再取1ml乙醇溶解液至100ml量瓶中，加乙醇溶解至刻度，摇匀，即得，其中每ml含绿原酸0.0005mg。
4.标准曲线的绘制：
线性关系考察：精密吸取绿原酸对照品溶液(0.0005mg/ml)5、10、15、20、25μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积y为纵坐标，以进样量x(μg)为横坐标，进行回归分析，得回归方程y＝4×106x+804.6；r2＝0.9975；表明绿原酸在0.0025～0.0125μg间线性关系良好。峰面积见下表1。
表1.不同进样量的绿原酸对照品溶液的吸收峰面积
5.供试品含量测定
分别取实施例1和实施例2中的绿原酸单体结晶及高纯度绿原酸单体结晶各2mg，精密称定，用乙醇溶解并定容至10ml，再取1ml稀释至100ml，在步骤2所述色谱条件下测定，进样量为5μl，计算绿原酸的含量，测定结果见下表2。
表2.实施例中样品绿原酸的含量测定
二、总黄酮的含量测定
1.仪器和试剂：uv-300型紫外可见分光光度计；芦丁标准品(购自中国食品药品检定研究院)
2.芦丁对照品溶液的配制：精密称量芦丁对照品3.0mg至10ml容量瓶中，加甲醇溶解后稀释至刻度线，摇匀即得芦丁对照品溶液，浓度为0.307mg/ml。
3.最大吸收波长及标准曲线确定
精密量取对照品溶液1ml至10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度后摇匀备用；另取s07得到的金银花总黄酮5mg加入100ml容量瓶中，甲醇溶解后稀释至刻度线，摇匀即得供试品溶液，取上述的对照品溶液和供试品溶液，进行全波长扫描，对照品和供试品吸收曲线均在510nm处有最大吸收，故本实验用510nm作为测定波长。
分别精密吸取对照品标准溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml至10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度后摇匀备用。以相应的试剂为空白溶液，在510nm下测定吸光度，以吸光度(a)为纵坐标，浓度(c)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为a＝10.814c–0.01，r2＝0.9924；对照品溶液在0.01535～0.07675mg/ml浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。
4.供试品溶液的制备
分别取实施例1和实施例2所得的金银花总黄酮5mg，精密称定后置于100ml容量瓶中，甲醇溶解后稀释至刻度线，摇匀即得供试品溶液。
5.金银花总黄酮纯度测定方法
取上述供试品溶液，于510nm下测定吸光度，根据标准曲线计算得出样品中总黄酮含量。具体见表3。
表3.实施例中样品总黄酮的含量测定
实施例2：
一种金银花中绿原酸和总黄酮的联合提取分离纯化方法，包括如下步骤：
s01，微波辅助浸润：取干燥至恒重的适量金银花药材并放入烧杯中，加入相当于金银花药材100倍量的去离子水，室温搅拌浸泡2h后，放入微波萃取机中，微波萃取温度为60℃，微波萃取功率为500w，微波萃取时间为30min；
s02，水热法-酸法联合提取金银花中的绿原酸和总黄酮：在s01经微波辅助浸润的烧杯中加入弱酸性缓冲溶液体系，调节浸润液的ph值为6，将烧杯中的浸润液及金银花药材倒入高压反应釜中，设定反应温度为200℃，反应时间为30min；一次提取完毕后，放出一次提取液，取相当于金银花药材干重60倍量的去离子水，并在去离子水中加入弱酸性缓冲溶液体系，调节去离子水的ph值为6，再将调节好ph值的去离子水加入高压反应釜中，进行二次提取，二次提取的反应温度为150℃，反应时间为15min，反应完毕后，放出二次提取液，合并一次提取液和二次提取液，离心后取上清液，上清液浓缩至金银花药材干重的3倍量后，停止浓缩，得提取浓缩液；
s03，醇沉：取提取浓缩液，加入纯乙醇进行醇沉，纯乙醇的加入量为提取浓缩液的4倍量，边加边搅拌，纯乙醇滴加完毕后，室温静置16h后，过滤，取滤液一，滤液一浓缩至无醇味后，再次过滤，得滤液二；
s04，萃取除杂：滤液二先用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，弃去石油醚层和乙酸乙酯层，取水层；
s05，过层析柱分离绿原酸和总黄酮：水层挥发至无有机溶剂味道后，过强极性大孔吸附树脂柱，40％乙醇洗脱6个柱体积得绿原酸有效部位，80％乙醇洗脱5个柱体积得总黄酮有效部位；
s06，绿原酸的精制：取40％乙醇洗脱部位，过滤后干燥，干燥品用乙醇溶解，乙醇的加入量相当于干燥品的5倍量，干燥品与乙醇的比例为重量体积比，滤过，滤液中加入2滴氨水后搅拌均匀，再逐滴加入相当于乙醇30倍量的乙酸乙酯，边加边搅拌，滴加完毕后将重结晶溶液置于0℃的冰箱后，过夜后取出，析出结晶，过滤，结晶洗涤至中性，干燥，得绿原酸单体结晶；
s07，总黄酮的精制：取80％乙醇洗脱部位，过滤后浓缩，浓缩至无醇味后，在浓缩液中加入活性炭吸附颗粒，磁力搅拌4h后，过滤，滤液浓缩后干燥，得金银花总黄酮。
优选地，弱酸性缓冲溶液体系为kh2po4-k2hpo4混合溶液。
优选地，每次萃取时，石油醚和乙酸乙酯的加入量分别为滤液二体积的1.5倍量，每次萃取时振摇，每次振摇时间为50min，振摇后静置8h再分层。
优选地，强极性大孔吸附树脂柱为ads-2、d-204、xda-2中的任意一种；进一步优选地，强极性大孔吸附树脂柱为d-204。
优选地，干燥品在乙醇溶液中采用超声溶解，超声溶解温度为55℃，超声频率为10khz。
优选地，活性炭吸附颗粒的粒径为1～5mm；进一步优选地，活性炭吸附颗粒的加入量相当于银花药材干重的5％。
进一步优选地，绿原酸单体结晶用丙酮保温复溶，丙酮的加入量相当于绿原酸单体结晶干重的3倍量，绿原酸单体结晶与丙酮的比例为重量体积比，丙酮保温的温度为60℃，再逐滴加入乙酸乙酯，边加边搅拌，乙酸乙酯的加入量为丙酮体积的50倍量，进行二次重结晶，将二次重结晶溶液放入超低温保存箱，冷藏温度为-50℃，次日取出，放置于室温后，过滤，干燥，得高纯度绿原酸单体结晶。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。