本发明属于植物有效成分提取技术领域，涉及一种同时从烟叶中提取并分离烟草绿原酸、芸香苷的方法。
背景技术：
我国烟草种植面积和产量均居世界首位，每年生产烟叶为200多万吨。据统计，2013年向国家上缴利税7000多亿元，因此，烟草生产及卷烟加工在我国国民经济中占有十分重要的地位。但是，近年来受全球气候变化、自然灾害频发和世界卫生组织倡导的“烟草控制框架公约”的影响，烟草企业出现烟叶收贮过量，约有30％的低次烟叶无法用于卷烟生产。据统计，当前烟叶库存水平已达到37.2个月，占用资金达到3500亿左右，许多烟叶已大大超过自然醇化的最佳周期。尽管如此，适用于高档卷烟品牌的优质特色烟叶仍供不应求，为维持烟区烟叶生产和保护烟农的利益，每年企业还必须维持一定的烟叶采购量。因此，如何化解烟叶生产、库存与不适用烟叶之间的矛盾已成为烟草企业亟待解决的问题。
烟草属于国家专卖商品，这就意味着烟草企业必需找到一种将低次烟叶转变成非烟制品的途径，才能妥善处理这些不适用烟叶。为了探索既能协调烟叶供需矛盾，又可降低烟草企业收储成本，增加低次烟叶附加值的有效途径。本项目拟根据多年研究结果，采用现代生物化学分离纯化技术，对低次烟叶中含量在毫克以上，已经证明具有治疗疾病效果的次生代谢产物绿原酸和芸香苷进行分离纯化和化学修饰，开发出附加值较高的保健品和护肤品。项目所研发的系列产品不但可以广泛用于医药、保健品和美容护肤品领域，提升低次烟叶的附加值，而且将为烟草企业创造可观的经济效益和社会效益。
绿原酸是分布广泛的苯丙素类化合物，学名为咖啡酰奎尼酸，见式1，因咖啡酸可与奎尼酸3，4，5位羟基成酯键所以有单/双/三咖啡酰奎尼酸等不同异构体，都统称为绿原酸。烟叶中以3‐咖啡酰奎尼酸占主导成份。3‐咖啡酰奎尼酸(以下简称为绿原酸)具有很多生理功能。包括抗菌抑制炎症、降糖降脂保护肝脏功能等。
芸香苷又称芦丁，是一类黄酮类化合物，也属于多酚类，见式2，在烟草中含量也达到10mg/g左右的含量。是一种生物活性很强、临床应用广泛的中药。具有抗自由基活性、抗脂质过氧化、抗病毒、抗急性胰腺炎等药理作用，可用于多种慢性疾病的治疗。
现有商品绿原酸都提取于金银花和杜仲；芸香苷提取于槐花。也有从其他一些植物中提取云香苷的报道。采取的工艺一般改变温度、溶剂、料液比等参数提高提取率。通过CO2萃取、过大孔树脂等工艺分别提绿原酸和芦丁。由于烟叶中成分复杂，含有大量的糖、脂和其它有机物质，提取过程中大量的还原糖与氨基化合物产生美拉德反应，形成了深褐色的色素，严重影响绿原酸和芦丁提取效果。所以从低次烟叶中同时提取分离绿原酸和芸香苷远比单从金银花(富含绿原酸)和槐花(富含芸香苷)中提取绿原酸和芸香苷要复杂。专利104086425A报道了从烟叶中同时提取分离绿原酸、芸香苷、茄尼醇和烟碱的报道，我们根据该专利实例重复，并未实现绿原酸与芸香苷的有效分离，且色素呈深褐色，分离效果并未达到此专利所述的效果。至今，我们还未见在去糖和色素基础上同时分离绿原酸和芸香苷的工艺报道。
技术实现要素：
本发明针对研究现状，对从低次烟叶中同时分离绿原酸和芸香苷两种化合物的提取工艺进行了研究，目的是为了提供一种能同时分离绿原酸和芸香苷的有效方法。该方法节省了原料和试剂，降低了开发成本，达到良好的分离效果。
一种同时从烟叶中提取分离绿原酸和芸香苷的方法：包括以下步骤：
1)烟草原料粉碎后以水为溶剂一次提取，获得烟草绿原酸、芸香苷的粗提液；
2)用有机溶剂萃取粗提液，获得去脂的提取液；
3)提取液上柱进行绿原酸及芸香苷的柱层析分离。
步骤1)中将烟草原料粉碎60目过筛。
步骤1)中设定提取温度50-60℃，料液质量体积比1:20-25(W/V，g/mL)条件下，用水提取90-150min；优选温度50℃，料液质量体积比1:20(W/V,g/mL)，用水提取120min。
步骤2)中按照粗提液与石油醚体积比1:1-1.2萃取，优选体积比1:1，获得去脂的提取液。
步骤3)中选择AB-8或者HPD-100型号树脂。
步骤3)先用5倍提取液体积的水洗脱，直至洗脱液中无糖检测出。
步骤3)用水洗脱后，改换洗脱液为不同浓度的乙醇梯度洗脱。
步骤3)分别收集10-15％浓度的乙醇洗脱液和30-40％浓度的乙醇洗脱液得到绿原酸溶液和芸香苷溶液。具体是以每小时洗脱2倍树脂体积的洗脱速度，采用10％、13％、15％浓度的乙醇梯度洗脱收集得到绿原酸溶液；采用30％、33％、36％、40％浓度的乙醇梯度洗脱收集芸香苷溶液。洗脱收集的绿原酸溶液和芸香苷溶液分别浓缩后进行冷冻干燥，得到粗品粉末，溶解粉末进行结晶。
本发明的优势：
1、本发明直接采用水进行一次性提取，大大降低了提取成本，得到的烟草绿原酸、芸香苷的粗提液，烟草绿原酸、芸香苷的提取率分别达到84％，99％(根据回收率实验数据)。提取液中的绿原酸和芸香苷的含量分别达到21.7mg/g、16.5mg/g。
2、本发明萃取后提取液不加热浓缩，直接过大孔树脂，用水洗脱水溶性糖，避免了可溶性糖参加的美拉德反应，减少色素形成。
3、本发明上大孔树脂调整水和醇洗脱比例，在大孔树脂上有效去除色素。
4、本发明收集的10-15％乙醇洗脱液中绿原酸含量为20.2mg/g，提取率为93.1％(得到的绿原酸分离液中，芸香苷含量为3mg/g,HPLC法)，；30-40％乙醇洗脱液中芸香苷含量为11.5mg/g，提取率75.2％，(得到的芸香苷提取液中，绿原酸含量为0.8mg/g,HPLC法)。通过以上三个步骤，绿原酸和芸香苷近乎得到完全分离，最终提取率可以分别是81.9％和61％。
我们根据现有专利(104086425A)工艺步骤2(加入1％的壳聚糖溶液，除去杂质沉淀，调节pH至2，过夜，得到芸香苷沉淀，用热水溶解后于冰箱保存、结晶；剩余的提取液中测的绿原酸16.4mg/g，芸香苷11.2mg/g)对绿原酸和芸香苷进行分离，实际得到的结果是绿原酸提取率为60％，芸香苷的提取率56.2％，按照(104086425A)步骤工艺，绿原酸与芸香苷没有得到分离。
总之，本发明通过简单的工艺和安全廉价的溶剂实现了低次烟叶中绿原酸与芸香苷功能成分的同时彻底分离，操作极为简单，节省能源，环保安全，是实现工业生产的有效工艺。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非对本发明的限制。
实施例1：
一、烟草绿原酸、芸香苷的同时提取
称取过60目筛的烟叶粉末样品200g，以料液比1:20溶解于4000ml水中，倒入搅拌提取器并设定好提取温度50℃，搅拌提取时间120min进行提取。将得到的提取液进行抽滤，滤去残渣，收集滤液。滤液中烟草绿原酸、芸香苷的提取率分别达到84％，99％(根据回收率实验数据)。滤液中的绿原酸和芸香苷的含量分别达到21.7mg/g、16.5mg/g。将滤液按1:1体积比例的用量用石油醚萃取除杂，回收上层有机相，合并下层水相，即得绿原酸、芸香苷提取液。此时测得绿原芸、香苷含量分别为20.9mg/g、15.3mg/g。
二、烟草绿原酸、芸香苷的分离
1.分离绿原酸
将经过预处理的AB‐8型号大孔树脂装入层析柱，使柱面平整，无倾斜，柱床内无气泡，不分层。用盐酸溶液调节提取液pH为3，称量与大孔树脂同体积的提取液缓慢倒入层析柱内，以2BV/h(每小时洗脱2倍树脂体积)的洗脱速度使提取液流出，完毕后关闭活塞，静置30min使物料充分吸附。称量5倍树脂体积的蒸馏水，以2BV/h的流速洗脱吸附在填料中的糖分。配制10％、13％、15％的乙醇溶液，依次倒入层析柱内进行洗脱，用量同上，合并洗脱液可得绿原酸溶液。10-15％乙醇洗脱液中绿原酸含量为20.2mg/g，提取率为93.1％，其中，芸香苷含量为3mg/g,HPLC法。将绿原酸溶液减压浓缩，进行真空干燥处理，可得绿原酸粗品。粗品经过萃取、结晶等方法处理后，获得绿原酸纯品。
2.分离芸香苷
配制30％、33％、36％、40％的乙醇溶液，依次倒入同一根层析柱内进行洗脱，用量同上，合并洗脱液可得芸香苷溶液。30-40％乙醇洗脱液中芸香苷含量为11.5mg/g，提取率75.2％，其中，绿原酸含量为0.8mg/g,HPLC法。将芸香苷溶液减压浓缩，进行真空干燥处理，可得芸香苷粗品。粗品经过萃取、结晶等方法处理后，获得芸香苷纯品。
绿原酸和芸香苷近乎得到完全分离，最终提取率可以分别是81.9％和61％。
实施例2：
一、烟草绿原酸、芸香苷的同时提取
称取过60目筛的烟叶粉末样品200g，以料液比1:25溶解于5000ml水中，倒入搅拌提取器并设定好提取温度50℃，搅拌提取时间120min进行提取。将得到的提取液进行抽滤，滤去残渣，收集滤液。将滤液按体积1:1比例的用量用石油醚萃取除杂，回收上层有机相，合并下层水相，即得绿原酸、芸香苷提取液。
二、烟草绿原酸、芸香苷的分离
1.分离绿原酸
将经过预处理的HPD‐100型号大孔树脂装入层析柱，使柱面平整，无倾斜，柱床内无气泡，不分层。用盐酸溶液调节提取液pH为3，称量与大孔树脂同体积的提取液缓慢倒入层析柱内，以2BV/h(每小时洗脱2倍树脂体积)的洗脱速度使提取液流出，完毕后关闭活塞，静置30min使物料充分吸附。称量5倍树脂体积的蒸馏水，以2BV/h的流速洗脱吸附在填料中的糖分。配制10％、13％、15％的乙醇溶液，依次倒入层析柱内进行洗脱，用量同上，合并洗脱液可得绿原酸溶液。经高效液相色谱检测，所得溶液中绿原酸含量占分离前提取液的84％以上。将绿原酸溶液减压浓缩，进行真空干燥处理，可得绿原酸粗品。粗品经过萃取、结晶等方法处理后，获得绿原酸纯品。
2.分离芸香苷
配制30％、33％、36％、40％的乙醇溶液，依次倒入同一根层析柱内进行洗脱，用量同上，合并洗脱液可得芸香苷溶液。经高效液相色谱检测，所得溶液中芸香苷含量占分离前提取液的64％以上。将芸香苷溶液减压浓缩，进行真空干燥处理，可得芸香苷粗品。粗品经过萃取、结晶等方法处理后，获得芸香苷纯品。
在本发明所述的操作条件范围内，本发明都能达到优于现有技术的满意效果，上述实施例1和2效果尤佳。