一种利用离子液体提取野菊花中绿原酸的方法与流程

本发明涉及中药材中活性成分的提取，尤其涉及一种利用离子液体提取野菊花中绿原酸的方法。

背景技术：

野菊花又名山菊花、苦薏、疟疾草,为菊科植物野菊的干燥头状花序,具有清热解毒、疏风平肝的功效，野菊花具有广谱抗菌、抗病毒等作用，绿原酸是野菊花中的主要活性成分之一。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，结构如下面所示。

根据咖啡酰在奎尼酸上的结合部位和数目不同，从理论上讲，单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体共有10种，分别为：1-咖啡酰奎尼酸、3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、1,3-二咖啡酰奎尼酸、1,5-二咖啡酰奎尼酸、1,6-二咖啡酰奎尼酸、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸、4,5-二咖啡酰奎尼酸。但到目前为止，从植物中发现的绿原酸异构体有如下：绿原酸(3-咖啡酰奎尼酸)、隐绿原酸(4-咖啡酰奎尼酸)、新绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸A(4，5-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸B(3，4-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸C(3，5-二咖啡酰奎尼酸)、莱蓟素(1，3-二咖啡酰奎尼酸)。

绿原酸具有广泛的生物活性，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日常化工等领域：(1)抗诱变及抗癌作用：绿原酸在碱性环境中为一促氧化剂，能导致肿瘤细胞产生较大的DNA碎片，并且引起核凝集，同时 也能增强芳烃羟化酶的活性；(2)抗心血管病变作用：较强促进前列腺环素(PGI2)的释放和抗血小板凝集作用，异绿原酸C也有促进PGI2的释放作用。另外,异绿原酸B对血小板血栓素的生物合成和氢过氧化物诱发的内皮素细胞损伤有极强的抑制作用；(3)抗肿瘤作用：绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用,被认为是癌症的有效化学防护剂；(4)抗菌、抗病毒作用。

现有的绿原酸提取方法包括水提醇析法、超临界流体萃取法、微波辅助提取法、大孔树脂吸附法等。水提醇析法工艺简单、经济，但水提液中杂质较多，醇析除杂时,醇浓度越高越有利于除去杂质,但损失率随之增大，绿原酸含量反而下降；超临界流体萃取法可通过调节压力来控制操作温度从而避免绿原酸在高温下分解，而且可将萃取和蒸馏合为一体，从而节省能源，但该方法投资和维护费用较高，不适合工业化生产；大孔吸附树脂具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快、操作简单、产品质量稳定、生产成本低等优点，但是该方法耗用时间长,清洗吸附树脂比较困难。微波辅助萃取不同于传统加热回流方式,其微波直接作用于溶剂和药材,热量和有效成分均由内向外传出,从而使得萃取时间短、提取效率高。微波提取各参数之间具有一定的交互作用，乙醇体积分数决定了溶剂的极性大小,与微波的吸收效果关系密切,直接影响微波萃取的效果，乙醇体积分数不同,对绿原酸的溶解能力不一样,从而影响其溶出度。

离子液体是由一种含氮杂环的有机阳离子和一种无机阴离子组成的盐，在室温或室温附近温度下呈液态，与传统的有机溶剂和电解质相比，离子液体具有以下优点：几乎没有蒸汽压、不挥发、无色、无味；有较大的稳定温度范围，较好的化学稳定性及较宽的电化学稳定点位窗口；通过阴阳离子的设计可调节其对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性，并且其酸度可调至超酸。因此，利用离子液体对现有的野菊花中绿原酸的提取方法进行改进，从而获得一套完善的从野菊花中提取绿原酸的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种操作简单、提取率高的利用离子液体提取野菊花中绿原酸的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用离子液体提取野菊花中绿原酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品萃取：称取野菊花粉末样品放入容器中，加入固液比为1:10～30的离子液体溶液，200～600w微波功率下微波辅助提取2～10min；

(2)检测：采用HPLC进行检测，HPLC色谱条件为：柱温为70℃；检测波长为327nm；流动相为乙腈-0.4％磷酸水溶液；流速为0.8～1.0ml/min；进样量为10μm，绿原酸标准品进样量为5μm。

离子液体是由一种含氮杂环的有机阳离子和一种无机阴离子组成的盐，在室温或室 温附近温度下呈液态，又称为温室离子液体、室温熔融盐、有机离子液体等，本发明中作为优选，所述离子液体溶液由体积比为1:4～8的离子液体和甲醇混合而成，所述离子液体为[Bmim]Br、[Bmim]BF₄、[Hmim]BF₄、[Dmim]BF₄中的至少一种。

离子液体溶液所具有的强萃取能力与其自身的性质有关，一方面，离子液体具有多种分子作用力和强的溶解能力，尤其是氢键作用力、极性作用力、离子电荷作用力等，这些作用有助于绿原酸在离子液体中溶解，从而使绿原酸从野菊花中能有效地提取出来；另一方面，离子液体是由有机阳离子和有机或无机阴离子组成的有机盐，对微波具有强的吸收和转化能力团，能有效提高离子液体溶液对微波的吸收和转化，使溶剂和样品迅速升温，所以能够快速提取出野菊花中的绿原酸，因此，所述离子液体溶液中的离子液体为[Bmim]Br，[Bmim]Br与甲醇的体积比为1:7。

作为优选所述步骤(1)中荷叶粉末样品与离子液体溶液的固液比为1:15。

作为优选，所述步骤(1)中微波功率为300w，提取时间为10min，提取温度为60℃。

作为优选，所述步骤(2)中的流动相中乙腈-0.4％磷酸水溶液体积比为15:85，流速为1ml/min

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中利用离子液体与甲醇混合形成离子液体溶液作为萃取剂，结合微波辅助提取，避免了现有的野菊花绿原酸提取中目标产物分解、提取率较低的问题，从而获得满意的提取率，该方法操作简单、萃取时间短，提取效率高，与现有的绿原酸提取方法相比具有显著的优势，可广泛应用于中药制药领域中绿以原酸为主要活性成分的药剂的制备。

附图说明

图1为实施例1的1-2中绿原酸标准曲线图；

图2为实施例2的2-1中不同离子液体溶液对绿原酸萃取效果的影响；

图3为实施例2的2-1中[Bmim]Br离子液体溶液的HPLC图谱；

图4为实施例2的2-2中离子液体浓度对绿原酸萃取率的影响；

图5为实施例2的2-2中离子液体浓度为1:7时的绿原酸萃取率；

图6为实施例2的2-3中不同微波功率对绿原酸萃取率的影响；

图7为实施例2的2-3中微波功率为300w时的HPLC图谱；

图8为实施例2的2-4中萃取时间对绿原酸萃取率的影响；

图9为实施例2的2-4中萃取时间为10min时的HPLC图谱；

图10为实施例2的2-5中液固比对绿原酸萃取率的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：提取液中绿原酸含量测定的测定条件

1-1、HPLC色谱条件

因提取液中绿原酸含量与其最大吸收波长处的色谱峰面积呈线性关系，因此试验以野菊花提取液中绿原酸的色谱峰面积为考察指标。将定容后的提取液利用HPLC测定提取液中绿原酸的含量。

HPLC色谱条件为：柱温为70℃；检测波长为327nm；流动相为乙腈：0.4％磷酸水溶液(15:85)，流速为1.0ml/min，进样量为10μm，绿原酸标准品(中国药检所)进样量为5μm。

1-2、标准曲线的制备

精密量取绿原酸标准品5mg，定容在10ml的容量瓶中备用，分别配置成浓度分别为0.04mg/ml、0.08mg/ml、0.12mg/ml、0.16mg/ml、0.2mg/ml绿原酸标准品溶液，按照上述HPLC测定条件测定野菊花中绿原酸含量。以峰面积为纵坐标，绿原酸浓度为横坐标制作标准曲线，绿原酸标准品浓度及其所对应的峰面积如表1所示，结果显示绿原酸在40.00～200.00ug×ml^-1的范围内呈良好的线性关系，回归方程为：y＝23572x+7.3600，R²＝0.9994，如图1所示。

表1 绿原酸标准品浓度及其所对应的峰面积

萃取率的计算：萃取率(％)＝[一次提取的荷叶碱的质量(mg)/提取样品的总量(mg)]×100％。

实施例2：野菊花中绿原酸提取条件确定

野菊花(由浙江海洋学院药学实验室提供)去除杂质后，粉碎得野菊花粉末，将野菊花粉末存于密封袋中备用。准确称取野菊花粉末至圆底三颈瓶中，加入离子液体，在一定微波功率下微波提取绿原酸。拟定提取条件为液料比1:15，时间5min，功率300w，温度70℃。

2-1、离子液体种类的选择

准确称取3g野菊花粉末5份，设定提取温度为70℃，固液比为1:15，功率为300w，提取时间5min，分别选取如表2中的4种不同的离子液体与甲醇混合(V_离子液体/V_甲醇＝1:4)制成离子液体溶液进行萃取。

表2 离子液体的种类

由表2、图2可知，当使用2号萃取溶液([Bmim]Br)其峰面积最大，相应地，其萃取率也最大，因此本实施例中选择[Bmim]Br作为离子液体，[Bmim]Br离子液体溶液的HPLC图谱如图3所示。

2-2、离子液体浓度的选择

称取5g野菊花粉末5份，设定温度为70℃，液固比为1：15，功率为300W，离子液体为[Bmim]Br，时间为10min，分别加入如表3中所示的不同浓度的离子液体制得离子液体溶液，进行绿原酸提取，结果如图4所示。

表3 离子液体的浓度

由图4可知，2号离子液体溶液的萃取率最高，因此离子液体的最佳浓度为1:7(V_离子液体/V_甲醇)，图5为离子液体浓度为1：7时的HPLC图谱。

2-3、微波功率的选择

分别以微波功率200w、300w、400w、500w、600w为微波辅助萃取功率，其他萃取条件为：[Bmim]Br(V_离子液体/V_甲醇＝1:7)、固液比为1:15、萃取10min，各微波功率所对应的峰面积如表4所示，萃取完毕后各微波功率所对应的萃取液温度(℃)如表5所示，不同微波功率对绿原酸萃取的影响如图6所示。

表4 微波功率所对应的萃取液温度

表5 微波功率所对应的峰面积

从图6中可看出微波功率在200W～300W之间时峰面积逐渐增大，而300W～600W变化时，峰面积逐渐降低，可看出微波功率为300W时提取效果最佳。可见，随着功率的增加，提取率慢慢增加，当到达一定功率时，提取率慢慢降低。在本实施例中，当功率到达300W时到达最佳提取功率，提取率最高，微波功率时300w的HPLC图谱如图7所示。

2-4、萃取时间的选择

分别选择2min、4min、6min、8min、10min为萃取时间，其他萃取条件为：

[Bmim]Br(V_离子液体/V_甲醇＝1:7)、微波功率300w照射、、固液比为1:15。各萃取时间所对应的峰面积如表6所示，不同萃取时间对绿原酸萃取率的影响如图8所示。

表6 时间所对应的峰面积

由图8可知，当萃取时间位于2min～10min时，绿原酸萃取率随萃取时间的增加而不断增加，当超过10min后，萃取率随萃取时间的增加开始下降。因此，萃取时间10min为最佳萃取时间，萃取时间10min的HPLC图谱如图9所示。

2-5、液固比的选择

分别以液固比10、15、20、25、30(即固液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)的萃取溶液，其他萃取条件为：[Bmim]Br(V_离子液体/V_甲醇＝1:7)、微波功率300w、萃取时间10min。各液固比所对应的峰面积如表7所示，不同液固比对绿原酸萃取率的影响如图10所示。

表7 液固比所对应的峰面积

由图10可知，当液固比由10～15变化时，绿原酸的萃取率不断增加，而液固比由15～30变化时，提取率随液固比的增加而下降。当液固比增加到一定程度后，萃取率的不增加反而有所下降，是因为溶剂已将有效物质充分提出，再增加萃取溶剂以无法增加有效物质的萃取率。由此可见，本实验中液固比15时最佳萃取条件。