本发明涉及一种从烟草废料中提取绿原酸的制备方法，属于绿原酸领域。
背景技术：
绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，属于苯丙素类化合物，主要存于金银花、杜仲、可可树以及咖啡等植物中。绿原酸作为药物合成的重要原料，对防治心血管系统疾病、糖尿病有显著的疗效，也广泛应用与食品保鲜、化妆品中抗衰老以及预防肥预等方面，在医药及人口健康等领域具有广阔的市场应用前景。但绿原酸本身具有不稳定性，从植物中提取的过程中，高温、强光以及长时间加热等条件可加速绿原酸水解以及分子内酯基迁移，发生绿原酸异构化。
目前，植物提取物的浓缩过程通常由加热、常减压蒸馏的办法来实现。但由于长时间加热，可使溶液中的绿原酸分解，使绿原酸产品得率降低。而以金银花为原料生产绿原酸是我国绿原酸的主要生产方式。目前，国内金银花中绿原酸的制备一般是先将绿原酸提取液醇沉或絮凝沉淀后，采用大孔树脂进行分离纯化，但是，在生成沉淀的过程中会伴有绿原酸的包夹，导致绿原酸的大量损失，产率低。另外，沉淀法除杂效果差，产品纯度低。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：针对以金银花为主要原料并采用大孔树脂进行分离纯化，而导致绿原酸的大量损失，产率低，同时制备的绿原酸杂质多，纯度低的问题，本发明主要是以烟草废料为主要原料，利用无水乙醇对其进行超声萃取，得到滤液和滤渣，将滤渣进行酶解，得到烟草废料酶解液，将其进行分离，得到的上清液与滤液混合后，并利用CO2超临界萃取，得到多酚类化合物溶液，最后利用液氮对其降温提取，即可得到绿原酸。本发明制备的绿原酸产率高，纯度高，可应用于大规模生产中。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
（1）称取30～40g烟草废料，用去离子水进行洗涤3～5次，并用粉碎机粉碎，将粉碎后的烟草粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入300～400mL无水乙醇，并置于3000～3200W超声波萃取机上，超声提取40～50min，过滤，分别收集滤液和滤渣，滤液备用；
（2）将滤渣置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入300～400mL无水乙醇、50～100mLpH为6.8～7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌30～40min，再向酶解罐中依次加入0.5～0.7g果胶酶、1～3g纤维素酶、1～3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45～55℃，搅拌反应2～3h，反应结束，将温度升至110～120℃，加热20～30min，再降温至室温，得到烟草废料酶解液；
（3）将上述烟草废料酶解液放入6000～8000r/min离心机中离心分离10～20min，弃去下层杂质，得到烟草废料酶解上清液，再将所得酶解上清液与步骤（1）中备用的滤液加入CO2超临界萃取仪中，再加入100～200mL无水乙醇，控制萃取压力为25～35MPa，萃取温度为35～40℃，CO2的流量为25～35kg/h，萃取20～30min，得到多酚类化合物溶液；
（4）向上述多酚类化合物溶液中加入2～4g活性炭，搅拌5～10min，过滤，得滤液，用0.5～0.7L液氮喷淋滤液，使滤液温度降至-50～-40℃，过滤，得到滤渣，将滤渣置于烧瓶中，向烧瓶中加入200～300mL无水乙醇，将0.1～0.3L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-30～-20℃，过滤，得到滤液，再用0.3～0.5L液氮喷淋滤液，使溶液温度降至-40～-30℃，过滤，收集滤渣；
（5）将上述收集的滤渣置于25～30℃真空干燥箱内干燥1～2h，即可得到从烟草废料中提取的绿原酸。
本发明的应用方法：称取10～15g上述制备的从烟草废料中提取的绿原酸，将其溶解于150～200mL质量分数为15％乙醇溶液中，待溶解完成后，向其加入1～2g甜菊素，2～3g苯甲酸钠，搅拌混合直至均匀，再利用质量分数为15％碳酸氢钠调节其pH值为7.0～7.5，待调节结束后，经活性炭进行脱色，再经微孔滤膜过滤，将滤液灭菌即可得到口服液，该口服液可用于保健药品，具有清热解毒，养颜润肤、解救等功效。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明主要利用液氮冷冻提取，避免了绿原酸大量损失，提高了其提取率，提取率达到97％以上；
（2）本发明从烟草废料中提取的绿原酸纯度较高，达到98％以上；
（3）本发明主要是以烟草废料为主原料，资源化再利用，所需成本低，且制备步骤简单。
具体实施方式
首先称取30～40g烟草废料，用去离子水进行洗涤3～5次，并用粉碎机粉碎，将粉碎后的烟草粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入300～400mL无水乙醇，并置于3000～3200W超声波萃取机上，超声提取40～50min，过滤，分别收集滤液和滤渣，滤液备用；再将滤渣置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入300～400mL无水乙醇、50～100mLpH为6.8～7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌30～40min，再向酶解罐中依次加入0.5～0.7g果胶酶、1～3g纤维素酶、1～3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45～55℃，搅拌反应2～3h，反应结束，将温度升至110～120℃，加热20～30min，再降温至室温，得到烟草废料酶解液；接着将上述烟草废料酶解液放入6000～8000r/min离心机中离心分离10～20min，弃去下层杂质，得到烟草废料酶解上清液，再将所得酶解上清液与备用的滤液加入CO2超临界萃取仪中，再加入100～200mL无水乙醇，控制萃取压力为25～35MPa，萃取温度为35～40℃，CO2的流量为25～35kg/h，萃取20～30min，得到多酚类化合物溶液；再向上述多酚类化合物溶液中加入2～4g活性炭，搅拌5～10min，过滤，得滤液，用0.5～0.7L液氮喷淋滤液，使滤液温度降至-50～-40℃，过滤，得到滤渣，将滤渣置于烧瓶中，向烧瓶中加入200～300mL无水乙醇，将0.1～0.3L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-30～-20℃，过滤，得到滤液，再用0.3～0.5L液氮喷淋滤液，使溶液温度降至-40～-30℃，过滤，收集滤渣；最后将上述收集的滤渣置于25～30℃真空干燥箱内干燥1～2h，即可得到从烟草废料中提取的绿原酸。
实例1
首先称取40g烟草废料，用去离子水进行洗涤5次，并用粉碎机粉碎，将粉碎后的烟草粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入400mL无水乙醇，并置于3200W超声波萃取机上，超声提取50min，过滤，分别收集滤液和滤渣，滤液备用；再将滤渣置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入400mL无水乙醇、100mLpH为7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌40min，再向酶解罐中依次加入0.7g果胶酶、3g纤维素酶、3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为55℃，搅拌反应3h，反应结束，将温度升至120℃，加热30min，再降温至室温，得到烟草废料酶解液；接着将上述烟草废料酶解液放入8000r/min离心机中离心分离20min，弃去下层杂质，得到烟草废料酶解上清液，再将所得酶解上清液与备用的滤液加入CO2超临界萃取仪中，再加入200mL无水乙醇，控制萃取压力为35MPa，萃取温度为40℃，CO2的流量为35kg/h，萃取30min，得到多酚类化合物溶液；再向上述多酚类化合物溶液中加入4g活性炭，搅拌10min，过滤，得滤液，用0.7L液氮喷淋滤液，使滤液温度降至-40℃，过滤，得到滤渣，将滤渣置于烧瓶中，向烧瓶中加入300mL无水乙醇，将0.3L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-20℃，过滤，得到滤液，再用0.5L液氮喷淋滤液，使溶液温度降至-30℃，过滤，收集滤渣；最后将上述收集的滤渣置于30℃真空干燥箱内干燥2h，即可得到从烟草废料中提取的绿原酸。
称取15g上述制备的从烟草废料中提取的绿原酸，将其溶解于200mL质量分数为15％乙醇溶液中，待溶解完成后，向其加入2g甜菊素，3g苯甲酸钠，搅拌混合直至均匀，再利用质量分数为15％碳酸氢钠调节其pH值为7.5，待调节结束后，经活性炭进行脱色，再经微孔滤膜过滤，将滤液灭菌即可得到口服液，该口服液可用于保健药品，具有清热解毒，养颜润肤、解救等功效。
实例2
首先称取30g烟草废料，用去离子水进行洗涤3次，并用粉碎机粉碎，将粉碎后的烟草粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入300mL无水乙醇，并置于3000W超声波萃取机上，超声提取40min，过滤，分别收集滤液和滤渣，滤液备用；再将滤渣置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入300mL无水乙醇、50mLpH为6.8磷酸盐缓冲溶液，搅拌30min，再向酶解罐中依次加入0.5g果胶酶、1g纤维素酶、1g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45℃，搅拌反应2h，反应结束，将温度升至110℃，加热20min，再降温至室温，得到烟草废料酶解液；接着将上述烟草废料酶解液放入6000r/min离心机中离心分离10min，弃去下层杂质，得到烟草废料酶解上清液，再将所得酶解上清液与备用的滤液加入CO2超临界萃取仪中，再加入100mL无水乙醇，控制萃取压力为25MPa，萃取温度为35℃，CO2的流量为25kg/h，萃取20min，得到多酚类化合物溶液；再向上述多酚类化合物溶液中加入2g活性炭，搅拌5min，过滤，得滤液，用0.5L液氮喷淋滤液，使滤液温度降至-50℃，过滤，得到滤渣，将滤渣置于烧瓶中，向烧瓶中加入200mL无水乙醇，将0.1L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-30℃，过滤，得到滤液，再用0.3L液氮喷淋滤液，使溶液温度降至-40℃，过滤，收集滤渣；最后将上述收集的滤渣置于25℃真空干燥箱内干燥1h，即可得到从烟草废料中提取的绿原酸。
称取10g上述制备的从烟草废料中提取的绿原酸，将其溶解于150mL质量分数为15％乙醇溶液中，待溶解完成后，向其加入1g甜菊素，2g苯甲酸钠，搅拌混合直至均匀，再利用质量分数为15％碳酸氢钠调节其pH值为7.0，待调节结束后，经活性炭进行脱色，再经微孔滤膜过滤，将滤液灭菌即可得到口服液，该口服液可用于保健药品，具有清热解毒，养颜润肤、解救等功效。
实例3
首先称取35g烟草废料，用去离子水进行洗涤4次，并用粉碎机粉碎，将粉碎后的烟草粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入350mL无水乙醇，并置于3100W超声波萃取机上，超声提取45min，过滤，分别收集滤液和滤渣，滤液备用；再将滤渣置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入350mL无水乙醇、70mLpH为6.9磷酸盐缓冲溶液，搅拌35min，再向酶解罐中依次加入0.6g果胶酶、2g纤维素酶、2g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为47℃，搅拌反应2h，反应结束，将温度升至115℃，加热25min，再降温至室温，得到烟草废料酶解液；接着将上述烟草废料酶解液放入7000r/min离心机中离心分离15min，弃去下层杂质，得到烟草废料酶解上清液，再将所得酶解上清液与备用的滤液加入CO2超临界萃取仪中，再加入150mL无水乙醇，控制萃取压力为30MPa，萃取温度为37℃，CO2的流量为30kg/h，萃取25min，得到多酚类化合物溶液；再向上述多酚类化合物溶液中加入3g活性炭，搅拌7min，过滤，得滤液，用0.6L液氮喷淋滤液，使滤液温度降至-45℃，过滤，得到滤渣，将滤渣置于烧瓶中，向烧瓶中加入250mL无水乙醇，将0.2L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-25℃，过滤，得到滤液，再用0.4L液氮喷淋滤液，使溶液温度降至-35℃，过滤，收集滤渣；最后将上述收集的滤渣置于27℃真空干燥箱内干燥1h，即可得到从烟草废料中提取的绿原酸。
称取12g上述制备的从烟草废料中提取的绿原酸，将其溶解于170mL质量分数为15％乙醇溶液中，待溶解完成后，向其加入1g甜菊素，2g苯甲酸钠，搅拌混合直至均匀，再利用质量分数为15％碳酸氢钠调节其pH值为7.2，待调节结束后，经活性炭进行脱色，再经微孔滤膜过滤，将滤液灭菌即可得到口服液，该口服液可用于保健药品，具有清热解毒，养颜润肤、解救等功效。