一株米曲霉及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一株对阿特拉津吸附且耐受的米曲霉。
背景技术：
：在世界人口不断增长的今天，人们对于人工合成的化学品农药越来越具有依赖性。每年在农业生产上都需要施用大量的化学品农药，这些化学品一部分产生作用，而另外很大一部分则残留在环境之中，导致土壤和农产品质量下降，同时威胁人体健康。针对农药污染，传统的治理方法主要以化学修复、物理-化学修复以及改良农艺措施等方法为主，这些方法在一定程度上能够解决土壤污染问题，但是也存在成本高、可能造成二次污染等问题。近年来利用生物降解和吸附的方法修复土壤污染受到越来越多人的关注，相比于传统生物方法被公认为是一种安全、高效、无污染和性价比高的修复方式。阿特拉津(atrazine，以下简称at，2-氯-4-乙基胺-6-异丙基胺-1,3,5-三嗪)又名莠去津，系三氮苯类农药。由于其成本低且除草效果好，已在世界各国得到了大面积的推广使用，是目前应用广泛的化学除草剂之一。研究表明，在所施用的农药中，有20％～70％会长期残留于土壤中；而阿特拉津的结构稳定、水溶性强、难以降解、被微生物矿化的过程十分缓慢，其在土壤中的存留时间随土壤的类型而有所不同，半衰期为8～52周。随着降水、淋溶和径流的作用，除草剂及降解产物会由土壤迁移入水体，引起地下水和地表水污染。研究表明阿特拉津对青蛙的变态发育和形态发育都会造成伤害，即使在低浓度阿特拉津存在的地表水中，对两栖类动物的发育也会产生有害的作用；同时阿特拉津也会造成体内重要代谢过程的紊乱；在一定剂量下对小鼠生殖细胞可能产生遗传损伤，且干扰精子的正常生成与成熟过程；阿特拉津不仅通过食物链的传递会对人体健康带来影响，使人体的肝、肾、肺、心脏及血管表现出中毒症状，而且也可能对人类心血管系统产生问题和出现再生繁殖困难问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株新型的耐受并吸附阿特拉津的米曲霉。本发明的另一个目的是提供一种所述米曲霉在修复阿特拉津污染的水体或土壤污染中的应用。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的第一个方面提供了一株米曲霉，该真菌菌株分类命名为米曲霉aspergillusoryzae，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmccno:15680。所述菌株米曲霉aspergillusoryzae的培养方法为：将菌株接种到发酵培养基，30±2℃、转速220rpm条件下震荡培养4-5d。所述发酵培养基的组成为：牛肉浸膏5g，葡萄糖10g，nacl10g，蒸馏水1000ml，ph7±0.2。所述菌株米曲霉aspergillusoryzae具有seqidno:1所示的18srdna序列。所述菌株米曲霉aspergillusoryzae的18srdna序列如下：ttatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagtaccttactacatggatacctgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaacctcgacttcggaaggggtgtatttattagataaaaaaccaatgcccttcggggctccttggtgattcataataacttaacgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtggcaacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacggggctcttttgggtctcgtaattggaatgagtacaatctaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaaccttgggtctggctggccggtccgcctcaccgcgagtactggtccggctggacctttccttctggggaacctcatggccttcactggctgtggggggaaccaggacttttactgtgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcctttgctcgaatacattagcatggaataatagaataggacgtgcggttctattttgttggtttctaggaccgccgtaatgattaatagggatagtcgggggcgtcagtattcagctgtcagaggtgaaattcttggatttgctgaagactaactactgcgaaagcattcgccaaggatgttttcattaatcagggaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcgggcggtgtttctatgatgacccgctcggcaccttacgagaaatcaaagtttttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggcaccacaaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacaaaataaggattgacagattgagagctctttcttgatcttttggatggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagacctcggcccttaaatagcccggtccgcgtt。所述菌株米曲霉aspergillusoryzae的原始细菌菌株是通过从阿特拉津污染的土壤中分离、筛选获得。本发明的第二个方面提供了一种所述米曲霉aspergillusoryzae在修复农药污染的水体或土壤中的应用。本发明的第三个方面提供了一种所述米曲霉aspergillusoryzae在修复阿特拉津污染的水体或土壤污染中的应用。所述米曲霉aspergillusoryzae吸附阿特拉津，吸附率可以达到85.9％。由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：本发明筛选到一株耐阿特拉津的曲霉菌米曲霉能够在6000mg/l的液体培养基中良好生长，该菌可用于阿特拉津污染的土壤、水体的治理中。对于低浓度污染的水体或土壤，相对于物理化学修复方法，采用本发明的菌株不仅能有效快速去除阿特拉津污染，而且绿色环保经济实惠。因此本发明菌株在阿特拉津污染的水体及土壤环境治理、工业场地农药污染的综合治理中具有非常高的应用价值。本发明以降低土壤以及地下水和地表水中的阿特拉津含量为技术背景，从土壤农药残留生物修复技术出发，筛选具有吸附、高耐受性吸附阿特拉津功能的微生物为研究目的，得到能够高效治理土壤阿特拉津污染的高效功能微生物米曲霉。本发明提供的米曲霉aspergillusoryzae能在6000mg/l的阿特拉津液体培养基中生长，在不同ph值和不同温度下，均对阿特拉津具有较强的去除能力。该菌在去除阿特拉津的过程中安全无污染，环境友好。因此本发明的菌株在阿特拉津重污染水体或者土壤环境治理中具有非常高的应用价值。本发明的菌株对阿特拉津的吸附率可以达到85.9％。生物材料样品的保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)地址：中国朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2018年5月24日保藏编号：cgmccno：15680分类命名：aspergillusoryzae附图说明图1为菌株ecust-txzc2018在固体平板上的生长前期的示意图。图2是菌株ecust-txzc2018在固体平板上的生长后期的示意图。图3是菌种进化树的示意图。图4是时间对阿特拉津吸附率的影响示意图。图5是ph对阿特拉津吸附率的影响示意图。图6是温度对阿特拉津吸附率的影响示意图。具体实施方式为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例所用试剂除另有注明，均可以从销售公司获得。本发明所用的菌株编号为ecust-txzc2018，于2018年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmccno：15680。本发明所用试剂具体信息如下：牛肉浸膏(固体物≥75％)上海源聚生物科技有限公司；脱脂牛奶生工生物工程(上海)股份有限公司；阿特拉津(99％)国家南方农药创制中心；其它未列出试剂均采购于上海泰坦科技有限公司，纯度皆为分析纯级别。实施例1本发明使用到的培养基(分离培养基)：牛肉浸膏葡萄糖培养基：牛肉浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠10g，阿特拉津200mg，蒸馏水1000ml，琼脂粉20g。本发明使用到的发酵培养基：牛肉浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph7±0.2。本发明的原始细菌菌株ecust-txzc2018是通过从阿特拉津污染的土壤中分离、筛选获得；该菌株的分离和培养方法，包括以下步骤：菌株米曲霉aspergillusoryzae的分离：将来自阿特拉津污染区的土壤10g装入90ml含200mg/l阿特拉津和500mg/l阿特拉津的液体牛肉浸膏葡萄糖培养基中富集培养，48h后取富集培养液做10-4、10-5、10-6梯度稀释，各取0.1ml涂布于含阿特拉津的牛肉浸膏葡萄糖培养基平板上，每个梯度3个重复，置于25℃培养3天。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落，获得纯化菌株，将纯化菌株接种于牛肉浸膏葡萄糖培养基斜面，放人4℃冰箱中保存备用。菌株的培养方法：将上述获得的纯化菌株ecust-txzc2018接种到牛肉浸膏葡萄糖培养基平板上28±2℃培养4-5d，随后进行鉴定。参照魏景超——《真菌鉴定手册》，依据菌体的个体、群体形态和生理、生化试验及18srdna序列进行测定。表1ecust-txzc2018生理生化指标碳源利用结果生理生化特征结果d-葡萄糖+明胶液化+l-阿拉伯糖+牛奶凝固与胨化+d-果糖+淀粉水解-d-木糖+纤维素降解-d-甘露醇+络氨酸水解-l-肌醇+硫化氢产生+蔗糖+麦芽糖+半乳糖+注：“+”表示利用或者产生；“-”表示不利用或不产生。该菌株通过pcr获得菌株ecust-txzc2018的18srdna序列，得到1287bp长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，序列测定及blast同源性对比与进化分析，结果表明ecust-txzc2018与aspergillusoryzaerib40的同源性为99％，同时结合表1的生理生化测试和形态结构观察结果分析，确定该菌为aspergillusoryzae的一个种，命名为米曲霉aspergillusoryzaeecust-txzc2018。本发明菌株对阿特拉津的最高耐受浓度为6000mg/l，在浓度为1mg/l的时候也有良好的吸附效果。图1为菌株ecust-txzc2018在固体平板上的生长前期的示意图，该时期菌落质地疏松，为白色或淡黄色，图2是菌株ecust-txzc2018在固体平板上的生长后期的示意图，此时期菌落变为褐色至淡绿褐色。图3是菌种进化树的示意图。所述菌株米曲霉aspergillusoryzae的18srdna序列如下：ttatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagtaccttactacatggatacctgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaacctcgacttcggaaggggtgtatttattagataaaaaaccaatgcccttcggggctccttggtgattcataataacttaacgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtggcaacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacggggctcttttgggtctcgtaattggaatgagtacaatctaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaaccttgggtctggctggccggtccgcctcaccgcgagtactggtccggctggacctttccttctggggaacctcatggccttcactggctgtggggggaaccaggacttttactgtgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcctttgctcgaatacattagcatggaataatagaataggacgtgcggttctattttgttggtttctaggaccgccgtaatgattaatagggatagtcgggggcgtcagtattcagctgtcagaggtgaaattcttggatttgctgaagactaactactgcgaaagcattcgccaaggatgttttcattaatcagggaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcgggcggtgtttctatgatgacccgctcggcaccttacgagaaatcaaagtttttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggcaccacaaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacaaaataaggattgacagattgagagctctttcttgatcttttggatggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagacctcggcccttaaatagcccggtccgcgtt实施例2米曲霉aspergillusoryzae的培养方法：将菌株米曲霉aspergillusoryzae接种到发酵培养基，30±2℃、转速220rpm条件下震荡培养4-5d。所述发酵培养基的组成为牛肉浸膏5g，葡萄糖10g，nacl10g和蒸馏水1000ml，ph7±0.2。实施例3菌株吸附阿特拉津特性的研究：ph、吸附时间、温度对吸附效果的影响实验。于牛肉浸膏葡萄糖培养基中28℃、220rpm对菌株进行扩大培养6h，得到的活化菌株在8000rpm条件下离心分离10min，得到的纯菌株用无菌水/稀硝酸洗涤2～3次，制备成浓缩菌液备用。使用1mol/l的naoh和hcl对含200mg/l阿特拉津的溶液调节ph分别为1、3、5、7、9；温度为15、20、25、30、35℃；接种5％(v/v)制备好的浓缩菌液于上述配置好的含阿特拉津的菌液中，定期取上清液测定阿特拉津含量。(1)吸附时间：结果如图4所示，图4是时间对阿特拉津吸附率的影响示意图。从图中可以看出，活菌体在200mg/l的初始阿特拉津浓度下的动态去除过程，菌体在前12-36h内去除迅速，此时的吸附率为77.5％；经过约72h基本达到吸附平衡，吸附率为85.9％，很可能是活细胞在快速的细胞表面吸附之后(12-36h)，发生了相对缓慢的胞内积累过程(36-72h)。(2)温度：结果如图6所示，图6是温度对阿特拉津吸附率的影响示意图。从图中可以看出，活菌体在200mg/l的初始阿特拉津浓度时，不同温度该菌株对阿特拉津吸附率的影响。在30℃时该菌株对阿特拉津的吸附率达到最大(78.2％)，即30℃是该菌株的最适吸附温度，而且在低温15℃和高温35℃时对于阿特拉津的吸附率依然在50％以上，说明其在不同温度条件都有很好的应用。(3)ph值：结果如图5所示，图5是ph对阿特拉津吸附率的影响示意图，由图中可以看出，在ph为1或3时，该菌株对于阿特拉津的吸附效率极低，在微酸性(ph＝5)和微碱性(ph＝9)的条件下都能具有60％以上的吸附效率，在ph为7时具有更好的吸附效率，这可能与该菌株菌体表面基团有关。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。序列表<110>华东理工大学<120>一株米曲霉及其应用<130>说明书、权利要求书<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1287<212>dna<213>米曲霉(aspergillusoryzae)<400>1ttatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagtacctt60actacatggatacctgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaacctcgacttcgga120aggggtgtatttattagataaaaaaccaatgcccttcggggctccttggtgattcataat180aacttaacgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttctgccctatca240actttcgatggtaggatagtggcctaccatggtggcaacgggtaacggggaattagggtt300cgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgc360aaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacggggctctttt420gggtctcgtaattggaatgagtacaatctaaatcccttaacgaggaacaattggagggca480agtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgca540gttaaaaagctcgtagttgaaccttgggtctggctggccggtccgcctcaccgcgagtac600tggtccggctggacctttccttctggggaacctcatggccttcactggctgtggggggaa660ccaggacttttactgtgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcctttgctcgaatacatt720agcatggaataatagaataggacgtgcggttctattttgttggtttctaggaccgccgta780atgattaatagggatagtcgggggcgtcagtattcagctgtcagaggtgaaattcttgga840tttgctgaagactaactactgcgaaagcattcgccaaggatgttttcattaatcagggaa900cgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgcc960gactagggatcgggcggtgtttctatgatgacccgctcggcaccttacgagaaatcaaag1020tttttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagg1080gcaccacaaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggt1140ccagacaaaataaggattgacagattgagagctctttcttgatcttttggatggtggtgc1200atggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagacct1260cggcccttaaatagcccggtccgcgtt1287当前第1页12