肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的高效制备方法与流程

本发明涉及一种肝素酶ⅰ的制备方法，尤其涉及一种使用渗透胁迫产生粗酶，并经一步cs层析纯化制备肝素酶ⅰ的方法。

背景技术：

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。

已从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶i、ii、iii，这三种酶的酶学特性各不相同。在肝素黄杆菌纯化出的三种肝素酶中，只有肝素酶ii的结构被解析，它的底物特异性也最差；肝素酶i则最适用于低分子量肝素的制备。

肝素酶ⅰ是一种分子量大约43kd的单体蛋白质，其等电点为9.0，可能是现有肝素酶中裂解肝素能力最强的酶，目前被大量用于凝血弹力图检测仪配用耗材肝素酶杯中。

肝素酶ⅰ的制备工作有许多研究报道，但已报道的制备工艺大都存在工艺复杂、收率低等缺点。

yang等人(jbiolchem，1985，260(3)：1849-1857)用羟基磷灰石处理、qae-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，首先制得纯酶，活性收率大约1％；

daniel等人(jbiochem，1992，267(34)：24347-24355)用羟基磷灰石处理、qae-葡聚糖凝胶层析、羟基磷灰石hplc、mono-sfplc、gpc-hplc等五步纯化，最终获得纯酶，活性回收率10.8％；

马小来等(食品与药品，2005，32(5)：446-450)使用羟基磷灰石处理、deae-sepharose柱层析、cm-cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到酶，活性收率13.4％；

xiaolaima等(jchromb，2006，843(2)：209-215)通过硫酸铵沉淀、octyl-sepharose柱层析、cm-650柱层析、sp-650柱层析、sephadexg-100柱层析等五步纯化法获得纯酶，收率达17.8％；

中国专利cn200910039360-一种肝素黄杆菌肝素酶ⅰ的制备方法，公开了一种工艺，通过对粗酶液进行连续三次洗脱条件各不相同的sp-sepharoseff层析，纯化得到高纯度的酶，获得高达30％的活性收率，为已报道的最高收率制备纯化技术。

绝大多数肝素酶制备工艺中粗酶从细胞中的释放采用超声破碎法，该法需要特殊设备，处理效率低，而且制得的粗酶含有的杂蛋白较多导致纯化步骤复杂。

zimmermann等(applbiochembiotechnol.1991aug；30(2):137-48.)通过渗透胁迫法使得肝素酶从菌体内部释放出来，可免于使用超声破碎仪。

本发明在借鉴使用渗透压胁迫法制备粗酶时，采用了新的工艺，降低了粗酶中的杂蛋白含量，粗酶从细胞中的释放处理效率大为提高，本发明进一步对粗酶进行纯化,发现使用cs柱层析可容易的获得高纯度的酶。而现有技术中使用cs柱层析则需要复杂的层析过程。

技术实现要素：

本发明提供一种新的肝素酶ⅰ的制备方法，可快速有效地通过一次柱层析即获得高纯度酶，进一步提高肝素酶ⅰ的纯酶活性收率。

本发明包括下述顺序的步骤：

(1)肝素黄杆菌的发酵制备：将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃、150rpm培养1天，然后按5％接种量二级种子培养基同样条件培养1天，再按5％接种量接入发酵培养基，培养2-3天，菌液10000rpm、4℃离心30分钟，收集沉淀，为含酶的菌体细胞；

(2)渗透胁迫法制备粗酶液：将含酶的菌体细胞4℃悬浮在蔗糖溶液中0.5-24小时，4℃、10000rpm离心30min，取沉淀悬浮于tris-hcl缓冲液中，冰浴中渗透胁迫提取0.5小时以上，再离心，得到的清液为粗酶提取液，将沉淀再渗透胁迫提取一次，合并二次提取液，即为粗酶液；

(3)肝素酶ⅰ的cs(cellufinesulfate)柱纯化：步骤(2)得到的粗酶液上一根用tris-hcl缓冲液平衡过的cs柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，再以梯度浓度线性上升的缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5m洗脱3-6个柱体积，收集有酶活性的含0.35-0.5m氯化钠缓冲液洗脱各管，合并，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到纯化的肝素酶ⅰ。

其中，步骤(1)所述的发酵培养基组成为：肝素8g/l，k2hpo42.5g/l，nah2po42.5g/l，nh4cl2.0g/l，mgcl20.5g/l，组氨酸0.5g/l，甲硫氨酸0.5g/l，微量元素namoo3、cucl2、fecl2、cocl2、mncl2、cacl2各1×10^-4m。步骤(1)所述的种子培养基和二级种子培养基的组成均为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl为0.5％，ph7.0。

其中，步骤(2)渗透压胁迫法所用蔗糖溶液为10-40％(m/v)，优选30-40％；所用tris-hcl缓冲液浓度为5-50mm，优选10-20mm；tris-hcl缓冲液含0.1-10mmcacl2，优选浓度为1-5mm；tris-hcl缓冲液含50-250mmnacl，优选浓度为100-200mm；tris-hcl缓冲液ph6.5-8.0，优选ph7.0-7.5)。

其中，步骤(3)所用tris-hcl缓冲液浓度为5-150mm，优选10-100mm；其ph在6.5-8.0之间，优选ph7.0-7.5；tris-hcl缓冲液含0.1-20mmcacl2，优选浓度为1-10mm。步骤(3)所用cs层析柱的填料优选使用chisso公司的亲和层析填料cellufinesulfate，也可使用其它类似亲和填料。

对本发明所得肝素酶ⅰ进行活性测定，测定方法如下：

肝素酶i活性测定：在5ml石英比色皿中加入在30℃预热过的2.5ml肝素浓度为1mg/ml的tris-hcl(50mm，含cacl210mm，ph7.0)缓冲液，移取5-20μl酶液，摇匀后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(iu/ml)。本发明中纯化中肝素酶ⅰ的酶活性为0.3-30iu/ml,最终获得的酶活性为9-10iu/ml。

对本发明所得肝素酶ⅰ进行蛋白质浓度测定，测定方法如下：

蛋白质浓度测定：向5ml考马斯亮蓝溶液中加蛋白0.1ml，摇匀，测定a595，根据标准曲线换算蛋白浓度。本发明纯化前粗酶蛋白质浓度为0.9-1.0mg/ml，纯化后肝素酶ⅰ的蛋白质浓度为0.05-0.1mg/ml。

本发明在现有技术的基础上对现有技术进行了改进，并对每一个步骤中的相关条件进行了筛选，以取得最好结果，本发明的筛选过程如下：

步骤1

步骤2

步骤3

经过本发明的研究改进，本发明的制备方法在以下方面优于现有技术

根据以上筛选数据，本发明的核心改进在于：

采用了一种渗透胁迫法将粗酶从细菌细胞中释放出来，并对过程中的蔗糖浓度、缓冲液浓度、氯化钙和氯化钠用量、ph值等做优化。

采用cs柱层析，使用了一种缓冲液浓度随氯化钠浓度同时线性梯度上升的洗脱方式，将肝素酶ⅰ只用一步柱层析即纯化获得，而现有技术基本都需要至少三步柱层析，在层析方法上比本发明复杂许多。通过上述改进，本发明借鉴采用渗透胁迫法产生粗酶，高效、快速，设备需求简单；本发明进一步借鉴柱层析进行纯化，意外的发现，纯化出肝素酶ⅰ只需要一步柱层析，即可达到现有技术中多出柱层析的结果，极为简单明了。所制备的肝素酶ⅰ比活可达135iu/mg，每升发酵液可最终得到约75iu的纯化肝素酶ⅰ，纯化工艺活性收率达到57％，高于已有报道的最高值约一倍。本发明所述制备方法，还具有工艺简单、产品单次制备量大、试剂成本低的特点，可用以工业大规模制备高纯度肝素酶ⅰ。

附图说明

图1.肝素酶经cs柱纯化后的组分分布

图2.肝素酶纯化前后电泳分析。其中：m-低分子量标准蛋白，c-粗酶液，e-纯化后的肝素酶ⅰ。

具体实施方式

下面结合实例对本发明所述内容作进一步阐述。

实施例1

肝素酶的发酵制备：从肝素黄杆菌平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基(牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl0.5％，ph7.0)中，23℃，150rpm，培养1天。按5％接种量接入二级种子培养基同样条件培养1天。再按5％接种量接入4l发酵培养基培养2天。发酵培养基组成：肝素8g/l，k2hpo42.5g/l，nah2po42.5g/l，nh4cl2.0g/l，mgcl20.5g/l，组氨酸0.5g/l，甲硫氨酸0.5g/l，微量元素namoo3、cucl2、fecl2、cocl2、mncl2、cacl2各1×10^-4m，ph7.0。23℃，150rpm，培养2天。菌液10000rpm，4℃离心30分钟，收集沉淀。

将含酶的菌体细胞4℃悬浮在40ml蔗糖溶液中2小时，4℃、10000rpm离心30min，取沉淀悬浮于80ml10mmtris-hcl缓冲液(含cacl21mm及nacl150mm、ph7.0)中，冰浴中渗透胁迫提取2小时以上，再如前离心，得到的160ml粗酶提取液，将沉淀再如前渗透胁迫提取一次，合并二次提取液，得到约400ml粗酶液。

将粗酶液用10mmtris-hcl缓冲液(含cacl21mm、ph7.0)稀释4倍，上一根用同样缓冲液平衡过的cs柱(2.5×40cm)，以10mmtris-hcl缓冲液(含cacl21mm、ph7.0)冲洗平衡300ml，以10mmtris-hcl缓冲液(含cacl21mm、ph7.0)至100mmtris-hcl缓冲液(含cacl210mm及nacl500mm、ph7.0)各300ml线形梯度洗脱柱子，测定各洗脱组分酶活力，结果如附图1。收集合并有酶活性的洗脱管第110-140管，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶ⅰ，冷冻保藏。纯化前后记录体积，并分别测定活性、蛋白浓度，计算比活性、总活性、收率等，见表1。对所制得的肝素酶ⅰ进行测定，活性为135.43iu/mg，纯化活性收率为57.13％，sds-page电泳显示为单一蛋白条带，见附图2。

表1.肝素酶ⅰ纯化表