一种利用pBV220表达载体高效表达色氨酸合成酶的方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用pbv220表达载体高效表达色氨酸合成酶的方法。

背景技术：

l-色氨酸(l-tryptophan)是人体内8种必需氨基酸之一，在人和动物生长发育及新陈代谢中起着重要作用，广泛用于医药、食品、化妆品和饲料等领域。目前，l-色氨酸的制备方法主要有直接发酵法、化学合成法和微生物酶转化法。微生物酶转化法具有底物专一性强、反应周期短、产物浓度高、分离提纯容易等优点，是生产l-色氨酸的有效方法。利用表达有色氨酸合成酶的全细胞催化合成l-色氨酸具有收率高和产品纯度高的优点。在大肠杆菌中，色氨酸合成酶是具有α2β2亚基结构的异四聚体，其α亚基、β亚基分别由trpa、trpb基因编码。在色氨酸代谢工程育种中，色氨酸合成酶是影响色氨酸产率的3个重要限制性酶之一。现有研究一般将紧密连锁的trpb和trpa基因(简称trpba)连接到pet系列原核表达载体，pet系列表达载体的启动子为lac强启动子，该启动子受大肠杆菌lac阻遏蛋白负调控，需要在异丙基硫代半乳糖苷(iptg)或乳糖诱导下表达目的蛋白。一方面，iptg价格高昂，且有一定的毒性；另一方面，如果采用价格相对较低且安全的乳糖，也存在许多问题，因为乳糖可以被大肠杆菌以碳源的形式代谢，导致色氨酸合成酶的表达不稳定。

pbv220表达载体属于温度敏感系统表达载体，该载体的启动子为pl和pr强启动子，该启动子受λ噬菌体ci基因负调控，当温度达到42℃时宿主菌表达目的蛋白。与化学诱导剂诱导宿主菌表达目的蛋白不同，温控表达载体只需要调节温度即可实现目的蛋白的大量表达，因此其大大节省了大规模工业生产的成本。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服原有技术的不足之处，提供了一种方法简单、操作方便、成本低廉，减少了大肠杆菌本身蛋白的表达，应用pbv220载体在42℃下诱导表达色氨酸合成酶的方法。

为实现本发明目的，提供了如下技术方案：

一种利用pbv220表达载体高效表达色氨酸合成酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以trpba-pet28a重组质粒为模板，并以pcr方法扩增出trpba目的基因片段；

(2)将步骤(1)扩增得到的基因片段连接到pbv220表达载体中，构建重组质粒trpba-pbv220；

(3)将重组质粒trpba-pbv220转化大肠杆菌bl21(de3)，得到重组大肠杆菌bl21(de3)/trpba-pbv220，并命名为重组大肠杆菌trpba-pbv220，适当条件下培养至对数中期，然后对其进行高温诱导表达，得到有色氨酸合成酶活性的工程菌；

其中步骤(1)所述的扩增色氨酸合成酶基因trpba的引物序列：

引物f：attggttaaaaattaaggagatgacaacattacttaa；

引物r：tctctcataagccaaaacagttaactgcgcgtcgccgct；

步骤(2)所述的将步骤(1)扩增得到的基因片段连接到pbv220质粒中，是将扩增片段插入到sali克隆位点。

步骤(3)所述的适当培养条件优选37℃，高温优选42℃。

步骤(3)所设的活性测定是取酶反应液10ml置入带盖塑料离心管中，加入收集的湿菌体0.1g，盖紧盖子后摇匀，放入40℃摇床反应70min(其中预留10min预热时间)，取样点纸层析考察酶转化产物l-色氨酸浓度确定酶制剂活性。其中，酶反应液的配方参考(bioresourcetechnology102.3(2011):3554-3557.)的报道。即所述工程菌的色氨酸合成酶活性是通过催化丝氨酸和吲哚转化为色氨酸，并通过薄层层析法测定的。

将重组质粒trpba-pet28a按常规方法转化大肠杆菌bl21(de3)，得到重组大肠杆菌bl21(de3)/trpba-pet28a，并命名为重组大肠杆菌trpba-pet28a，用以对比本发明重组大肠杆菌trpba-pbv220的改进效果。

本发明具有下列优点及有益效果：

(1)采用本方法构建的色氨酸合成酶表达菌株，不需要使用化学诱导剂诱导表达，只需要调整温度即可得到大量有活性的色氨酸合成酶菌体，降低了生产成本，简化了工艺；

(2)摇瓶实验表明，优选37℃培养菌体，未检测到色氨酸合成酶的渗漏表达，菌体生长速度较采用pet系列表达载体快。而且只需要在42℃诱导5h，即可拥有较高活性，这可以缩短发酵时长，为提高大规模工业生产色氨酸合成酶菌体的效益奠定了基础。

附图说明

图1是本发明构建的重组trpba-pbv220表达菌株和重组trpba-pet28a表达菌株的生长曲线。

图2是本发明构建的重组trpba-pbv220菌株活性测定的薄层层析图；负：1％丝氨酸反应液；1：加入了重组trpba-pbv220菌的反应液；2：加入了重组trpba-pet28a菌的反应液；正：1％色氨酸。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。

实施例1

制备重组了trpba-pbv220的大肠杆菌菌株

用基因工程的方法制备重组了trpba-pbv220的大肠杆菌菌株：通过pcr方法扩增出紧密连锁的色氨酸合成酶基因trpba片段，采用无酶克隆将trpba连接到pbv220表达载体，然后加入dh5α大肠杆菌感受态细胞，进行常规转化并涂布平板，挑取单菌落进行pcr验证，将正确重组的菌落接种于小细菌瓶中并于37℃、200rpm的摇床上培养过夜。收集摇瓶中的菌体，用质粒小提试剂盒抽提得到重组质粒，测序验证。将抽提的质粒转化于bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞中，得到的单菌落，作为菌种进行发酵操作。

实施例2

重组菌株摇瓶发酵培养

将实施例1得到的trpba-pbv220菌株接种到含有50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体od600nm达到0.5时，移至42℃诱导5h，发酵结束时菌体od600nm达到3，在温度4℃，转速6000rpm，时间5min的条件下，离心，收集trpba-pbv220菌体。

为了比较本发明构建的重组trpba-pbv220表达菌株和重组trpba-pet28a表达菌株的生长情况，进行了生长曲线测定实验，结果如图1所示。

实施例3

重组菌株活性测定

酶反应液配制：分别称取1gl-丝氨酸和0.6g吲哚至70ml纯水中，搅拌均匀后依次加入1ml0.3％plp和1mltritonx-100，加5％naoh溶液调ph到8.5，加纯水定容到100ml作为酶反应液备用。

酶活性检测：取酶反应液10ml置入带盖塑料离心管中，加入实施例2制备的静息细胞0.1g，盖紧盖子后摇匀，放入40℃摇床反应70min(其中预留10min预热时间)，取样点薄层层析考察酶转化产物l-色氨酸浓度确定重组菌株活性，活性测定结果如图2所示。