一种鼠李糖脂酸沉淀的方法与流程

本发明涉及到一种鼠李糖脂的酸沉淀方法。

背景技术：

鼠李糖脂是一种性能优良的生物表面活性剂，无毒、易生物降解，鼠李糖脂可用作乳化剂、破乳剂、功能性食品添加剂、洗涤剂和环境污染修复剂等，在农用化学品、食品饮料、化妆品和药品、环境污染治理、采矿冶金和石油石化工业等领域具有良好的应用前景，然而鼠李糖脂的分离一直是很棘手的难题，酸沉淀是普遍使用的一种方法，然而就酸沉淀本身仍然存在很多亟待的问题。

目前对鼠李糖脂的研究多集中于提高产率上及其应用效果上，在提取工艺方面的研究较少。酸沉淀是对于鼠李糖脂分离普遍适用的方法，因为其有简便、高效、回收率高等优点。现有的酸沉淀方法主要使用盐酸，硫酸调节ph，这些提取方法都存在着一些缺陷。其中盐酸是一种挥发性极强的酸，在使用过程中存在安全隐患。同时盐酸水溶液中含有氯离子，氯离子是化妆品中检测的指标之一，使用盐酸调节ph，会造成产品氯离子含量超标，使产品品质下降，而硫酸是一种强腐蚀酸，在使用过程中存在安全隐患。

技术实现要素：

本方法目的就在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简便、经济、高效的鼠李糖脂酸沉淀方法。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现：

一种鼠李糖脂酸沉淀的方法，包括如下步骤：

（1）将鼠李糖脂发酵液置于离心管中离心富集菌体，收集无菌的发酵液上清液；

（2）将步骤（1）中收集的发酵液上清液置于水浴锅中，90℃水浴60min；

（3）将（2）中水浴处理后的发酵液上清液置于离心管中离心富集蛋白，收集上清液；

（4）将（3）中收集的上清液量取体积，加入磷酸调节ph使鼠李糖脂析出，产生沉淀；

（5）将（4）中产生沉淀的发酵液置于离心管中离心富集鼠李糖脂沉淀，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体烘干，得到鼠李糖脂酸沉淀产品。

本发明的方法，所述步骤（1）中，离心条件为10000rpm，4℃，20min。

所述离心管为尖底离心管，可以更有利于富集菌体。

所述步骤（3）中，离心条件为6000rpm，4℃，10min。

所述步骤（4）中所用的酸为分析纯级的磷酸；加酸调节至ph=2，之后在4℃下静置3-18h。

所述步骤（5）中，离心条件为6000rpm，4℃，10min。

进一步的，本发明的方法还包括：取步骤（1）的发酵液上清液和步骤（5）中离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂损失率。

与现有的技术相比，本发明采用添加磷酸调节ph，可以很好的沉淀鼠李糖脂，重复性良好。该方法克服了现有技术中存在的危险性大，回收率低，产品品质差等缺陷，是一种工艺简单，适合工业化批次生产的简便、经济、高效的提取方法。

附图说明

图1为不同种类的酸沉淀对鼠李糖脂回收率的影响；

图2为不同种类的酸沉淀对鼠李糖脂产物纯度的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种鼠李糖脂酸沉淀的新方法，该方法主要包含以下步骤：

（1）将20ml鼠李糖脂发酵液均匀的分装于2个10ml尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃，离心20min，小心收集上清液。

（2）将步骤（1）中收集的上清液重新收集倒入烧杯中，放到事先加热到90℃的水浴锅中水浴60min。

（3）将（2）中处理结束的发酵液均匀分装于2个10ml的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并重新收集，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。

（4）将（3）中收集到的鼠李糖脂发酵液均匀分装于9个1.5ml的尖底离心管中，每管定量装1ml鼠李糖脂发酵液。分别加入磷酸、硫酸、盐酸、硝酸调节ph至2，在4℃静置3h。

（5）将（4）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体放入105℃烘箱，烘干沉淀称重。

（6）利用蒽酮硫酸法检测酸沉淀前和酸沉淀后的鼠李糖脂浓度。取定量酸沉淀前发酵液和步骤（5）中所述离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。酸沉淀前发酵液体积为1ml，测得的鼠李糖脂浓度为43.77g/l，酸沉淀后发酵液体积为1ml，如图1所示，测得的盐酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.45g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为92.1%。测得的硫酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.45g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为92.1%。测得的硝酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.94g/l,计算得到的鼠李糖脂回收率为91.0%。测得的磷酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为2.49g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为94.3%。

实施例2

一种鼠李糖脂酸沉淀的新方法，该方法主要包含以下步骤：

（1）将20ml鼠李糖脂发酵液均匀的分装于2个10ml尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃，离心20min，小心收集上清液。

（2）将步骤（1）中收集的上清液重新收集倒入烧杯中，放到事先加热到90℃的水浴锅中水浴60min。

（3）将（2）中处理结束的发酵液均匀分装于2个10ml的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并重新收集，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。

（4）将（3）中收集到的鼠李糖脂发酵液均匀分装于9个1.5ml的尖底离心管中，每管定量装1ml鼠李糖脂发酵液。分别加入磷酸、硫酸、盐酸、硝酸调节ph至2，在4℃静置6h。

（5）将（4）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体放入放入105℃烘箱，烘干沉淀称重。

（6）利用蒽酮硫酸法检测酸沉淀前和酸沉淀后的鼠李糖脂浓度。取定量酸沉淀前发酵液和步骤（5）中所述离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。酸沉淀前发酵液体积为1ml，测得的鼠李糖脂浓度为43.77g/l，酸沉淀后发酵液体积为1ml，如图1所示，测得的盐酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为2.49g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为94.3%。测得的硫酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.37g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为92.3%。测得的硝酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.84g/l,计算得到的鼠李糖脂回收率为91.23%。测得的磷酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为1.48g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为96.6%。

实施例3

一种鼠李糖脂酸沉淀的新方法，该方法主要包含以下步骤：

（1）将20ml鼠李糖脂发酵液均匀的分装于2个10ml尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃，离心20min，小心收集上清液。

（2）将步骤（1）中收集的上清液重新收集倒入烧杯中，放到事先加热到90℃的水浴锅中水浴60min。

（3）将（2）中处理结束的发酵液均匀分装于2个10ml的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并重新收集，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。

（4）将（3）中收集到的鼠李糖脂发酵液均匀分装于9个1.5ml的尖底离心管中，每管定量装1ml鼠李糖脂发酵液。分别加入磷酸、硫酸、盐酸、硝酸调节ph至2，在4℃静置9h。

（5）将（4）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体放入放入105℃烘箱，烘干沉淀称重。

（6）利用蒽酮硫酸法检测酸沉淀前和酸沉淀后的鼠李糖脂浓度。取定量酸沉淀前发酵液和步骤（5）中所述离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。酸沉淀前发酵液体积为1ml，测得的鼠李糖脂浓度为43.77g/l，酸沉淀后发酵液体积为1ml，如图1所示，测得的盐酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为1.76g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为95.99%。测得的硫酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为2.52g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为94.23%。测得的硝酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.07g/l,计算得到的鼠李糖脂回收率为92.95%。测得的磷酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为1.26g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为97.1%。

实施例4

一种鼠李糖脂酸沉淀的新方法，该方法主要包含以下步骤：

（1）将20ml鼠李糖脂发酵液均匀的分装于2个10ml尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃，离心20min，小心收集上清液。

（2）将步骤（1）中收集的上清液重新收集倒入烧杯中，放到事先加热到90℃的水浴锅中水浴60min。

（3）将（2）中处理结束的发酵液均匀分装于2个10ml的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并重新收集，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。

（4）将（3）中收集到的鼠李糖脂发酵液均匀分装于9个1.5ml的尖底离心管中，每管定量装1ml鼠李糖脂发酵液。分别加入磷酸、硫酸、盐酸、硝酸调节ph至2，在4℃静置18h。

（5）将（4）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体放入放入105℃烘箱，烘干沉淀称重。

（6）利用蒽酮硫酸法检测酸沉淀前和酸沉淀后的鼠李糖脂浓度。取定量酸沉淀前发酵液和步骤（5）中所述离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。酸沉淀前发酵液体积为1ml，测得的鼠李糖脂浓度为43.77g/l，酸沉淀后发酵液体积为1ml，如图1所示，测得的盐酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为1.63g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为96.28%。测得的硫酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为2.07g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为95.27%。测得的硝酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.06g/l,计算得到的鼠李糖脂回收率为92.94%。测得的磷酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为0.93g/l，计算得到鼠李糖脂回收率为97.87%。

实施例5

本实施例对实施例4获取的鼠李糖脂沉淀进行纯度测定。

（1）将烘干的鼠李糖脂于电子天平上准确称量，分别称取使用盐酸，硫酸，硝酸，磷酸酸沉淀所得的鼠李糖脂固体1g。

（2）使用纯水分别溶解鼠李糖脂，使用100ml容量瓶定容到100ml。配成10g/l的理论浓度。

（3）使用蒽酮比色法分别测量盐酸，硫酸，硝酸，磷酸酸沉淀配置成的鼠李糖脂溶液。测得浓度分别为5.810g/l，5.737g/l,5.510g/l,6.450g/l。计算得到纯度分别为58.10%，57.37%，55.10%，64.50%，如图2所示。