一种固液相结合制备齐考诺肽的方法与流程

本发明涉及多肽化合物合成技术领域，尤其涉及一种固液相结合制备齐考诺肽的方法。

背景技术

齐考诺肽英文名称ziconotide，是一种含有3个二硫键和25个氨基酸的多肽。分子式：c102h172n36o32s7，分子量：2639.13，序列和结构如式i所示

式1

齐考诺肽是一种非阿片类镇痛药物，适用于鞘内注射并且对其他治疗(如全身镇痛药、辅助治疗或鞘内注射吗啡)不能耐受或无效的严重慢性疼痛患者。齐考诺肽为含有3个二硫键和25个氨基酸的多肽。本品与位于脊髓背角浅层的初级伤害性传入神经上的n-型钙通道结合，抑制初级传人神经末梢兴奋性递质的释放，具有抗伤害感受作用。本品不与阿片受体结合，其药理作用也不被阿片受体拮抗剂所阻断。在动物模型中，本品可改变阿片引起的胃肠动力降低，但不能改善吗啡引起的呼吸抑制。给大鼠鞘内注射本品，同时给予吗啡、巴氯芬或可乐定，镇痛作用增强。本品与吗啡合用，不能防止大鼠对吗啡的耐受性。

现有的齐考诺肽的制备方法合成周期长，生产成本高，产品收率低，不利于齐考诺肽的大规模生产。cn200710301598，cn201110139661，cn201610947996公开了三种不同的合成齐考诺肽的方法，都是逐一偶联25个不同保护的氨基酸，随着肽链的延伸，偶联难度的增加，会导致多肽粗品纯度降低，纯化困难，收率降低的问题。cn201310202089和cn20150421787公开了一种全保护片段合成齐考诺肽的方法，其中cn201310202089选择了3个两肽片段来避免残肽的产生，cn20150421787则选择了全保护片段b（12-18）、c（6-11）、d（1-5）逐一偶联到片段a（19-25）树脂上，此类片段合成法都需要过量的全保护片段，而且制备大量片段也会造成成本提高，不利于后期工业化放大。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低不利于后期工业化放大的技术问题。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，包括如下步骤：

1.固液相结合制备带修饰的多肽片段a：{cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl}；

2.固相法制备多肽片段b：{cys-cys-thr-gly-ser-cys-arg-ser-gly-lys-cys-nh2}；

3.通过自然链接法,在液相条件下将修饰的多肽片段a链接到多肽片段b上，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-cys-cys-thr-gly-ser-cys-arg-ser-gly-lys-cys-nh2；

4.在同一体系下加入氧化剂，氧化得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱纯化冻干得到齐考诺肽精品。

其中：步骤1以fmoc-asp(otbu)-二氯树脂为固相载体，按照fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：fmoc-tyr(tbu)-oh,fmoc-met-oh,fmoc-leu-oh,fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-ser(tbu)-oh,fmoc-cys(trt)-oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-ala-oh,fmoc-gly-oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-gly-oh,fmoc-lys(boc)-oh,boc-cys(trt)-oh,得到boc-cys(trt)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(trt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-二氯树脂，经一次裂解得到全保护多肽boc-cys(trt)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(trt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cooh，再液相缩合苄硫醇，得到boc-cys(trt)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(trt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-sbzl，再经二次裂解去除保护基，得到多肽片段a：{cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl}。

步骤2以rnikamideam树脂为固相载体，按照fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：fmoc-cys(trt)-oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-gly-oh,fmoc-ser(tbu)-oh,fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-cys(trt)-oh,fmoc-ser(tbu)-oh,fmoc-gly-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-cys(trt)-oh,fmoc-cys(trt)-oh,得到nh2-cys(trt)-cys(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-cys(trt)-arg(pbf)-ser(tbu)-gly-lys(boc)-cys(trt)-rnikamideam树脂，裂解去除保护基，得到去保护多肽片段b：{cys-cys-thr-gly-ser-cys-arg-ser-gly-lys-cys-nh2}。

步骤3将等摩尔比的多肽片段a和多肽片段b溶于ph=6.5-7.5的pbs溶液中，搅拌反应0.5-2小时，lcms检测反应终点，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-cys-cys-thr-gly-ser-cys-arg-ser-gly-lys-cys-nh2。

步骤4在齐考诺肽线性肽粗品溶液中加入氧化剂，搅拌反应2-12小时，hplc监测反应终点，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，真空冻干得到齐考诺肽精品。

步骤5中，固相偶联每一个氨基酸，以dmf为溶剂，选择hbtu/nmm作为缩合剂；液相缩合苄硫醇，以dmf或nmp或dmf/nmp为溶剂，选择hbtu/nmm或hctu/nmm中的一种为缩合剂，搅拌反应0.5-2小时；

步骤5中，一次裂解液的配比为体积百分配比2%tfa/dcm，二次裂解液的配比（v%）组成为：87.5%tfa+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水；

步骤8中，固相偶联每一个氨基酸，以dmf为溶剂，选择hbtu/nmm作为缩合剂；裂解液的配比组成（v%）为：87.5%tfa+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水。

步骤11中所述的氧化剂为dmso，浓度为1%-5%v/v。

本发明中一些常用缩写具有以下含义：

hbtu：o-苯并三唑-n,n,n,n-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；

hctu：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯；

nmm：n-甲基吗啉；

cys：半胱氨酸；

lys：赖氨酸；

gly：甘氨酸；

ser：丝氨酸;

thr：苏氨酸；

asp：天冬氨酸；

met：蛋氨酸；

tyr：酪氨酸；

leu：亮氨酸；

arg：精氨酸；

ala：丙氨酸；

fmoc：芴甲氧羰基；

boc：叔丁氧羰基；

trt：三苯甲基；

tbu：叔丁基；

sbzl：硫苄酯

tfa：三氟乙酸；

dcm:二氯甲烷；

dmf：n,n-二甲基甲酰胺；

nmp:n-甲基吡咯烷酮；

dmso：二甲亚砜。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种固液相法结合制备齐考诺肽的方法，既能大大缩短合成周期，又能提高粗肽的纯度和收率，降低纯化难度。该方法选择合成两条ab肽链，策略性的在a链的c端加一个硫苄酯修饰，通过自然链接法将两条肽链结合成一条肽链，反应条件温和，且在同一体系中完成氧化反应，氧化条件温和，步骤精简，便于操作，适合于后期工业化生产。

附图说明

图1为实施例2产品质谱图。

图2为实施例6产品质谱图。

图3为实施例7中间体产品质谱图。

图4为实施例7产品质谱图。

图5为实施例7产品色谱图。

具体实施方式

以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述，但本发明不限于这具体实例。

实施例1：boc-cys(trt)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(trt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cooh的制备；

称取fmoc-asp(otbu)-2cl-trt-cl-树脂20g（0.3mmol/g）置于反应柱中，加入150ml体积百分配比20%哌啶/dmf溶液，反应30分钟，抽干，dmf洗涤5次，再称取保护氨基酸，缩合剂，加入到反应柱中，再加入100mldmf，反应30-60分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后排干反应液，dmf洗涤3次，反复循环，直至连完最后一个氨基酸，得到boc-cys(trt)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(trt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-2cl-trt-cl-树脂36g。

每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：

fmoc-tyr(tbu)-oh5.52g，

fmoc-met-oh4.46g，

fmoc-leu-oh4.24g，

fmoc-arg(pbf)-oh7.79g，

fmoc-ser(tbu)-oh4.6g，

fmoc-cys(trt)-oh7.03g，

fmoc-lys(boc)-oh5.62g，

fmoc-ala-oh3.74g，

fmoc-gly-oh3.57g，

fmoc-lys(boc)-oh5.62g，

fmoc-gly-oh3.57g，

fmoc-lys(boc)-oh5.62g，

boc-cys(trt)-oh5.56g；

每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：hbtu(4.32g)，nmm(2.72ml)；

取上述树脂36g置于烧瓶中，加入360ml一次裂解液，配比为体积百分配比2%tfa/dcm，置于摇床中常温震荡反应1小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，减压浓缩旋去溶剂，得到全保护多肽片段a：boc-cys(trt)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(trt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cooh16.8g。

实施例2：cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl的制备；

取实施例1中的全保护多肽片段a4.2g置于烧瓶中，加入100mldmf溶解，再加入0.37g苄硫醇，1.24ghctu，5mldiea，反应1小时，加水析出白色固体，过滤除去滤液，滤饼经干燥后再加入200ml二次裂解液，配比（v%）组成为：87.5%tfa+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，反应2小时，加入800ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段a：cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl2.25g，mw：1666，产品质谱图见图1。

实施例3：cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl的制备；

取实施例1中的全保护多肽片段a4.2g置于烧瓶中，加入100mlnmp溶解，再加入0.37g苄硫醇，1.24ghctu，5mldiea，反应2小时，加水析出白色固体，过滤除去滤液，滤饼经干燥后再加入200ml二次裂解液，配比（v%）组成为：87.5%tfa+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，反应2小时，加入800ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段a：cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl2.35g。

实施例4：cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl的制备；

取实施例1中的全保护多肽片段a4.2g置于烧瓶中，加入100mldmf溶解，再加入0.37g苄硫醇，1.14ghbtu，5mlnmm，反应1小时，加水析出白色固体，过滤除去滤液，滤饼经干燥后再加入200ml二次裂解液，配比（v%）组成为：87.5%tfa+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，反应2小时，加入800ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段a：cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl2.32g。

实施例5：cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl的制备；

取实施例1中的全保护多肽片段a4.2g置于烧瓶中，加入100mlnmp溶解，再加入0.37g苄硫醇，1.14ghbtu，5mlnmm，反应2小时，加水析出白色固体，过滤除去滤液，滤饼经干燥后再加入200ml二次裂解液，配比（v%）组成为：87.5%tfa+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，反应2小时，加入800ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段a：cys-lys-gly-lys-gly-ala-lys-cys-ser-arg-leu-met-tyr-asp-sbzl2.4g。

实施例6：cys-cys-thr-gly-ser-cys-arg-ser-gly-lys-cys-nh2的制备；

称取rinkamideam树脂20g（0.3mmol/g）置于反应柱中，加入150ml体积百分配比20%哌啶/dmf溶液，反应30分钟，抽干，dmf洗涤5次，再称取保护氨基酸，缩合剂，加入到反应柱中，再加入100mldmf，反应30-60分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后排干反应液，dmf洗涤3次，反复循环，直至连完最后一个氨基酸，再脱保护洗涤，得到cys(trt)-cys(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-cys(trt)-arg(pbf)-ser(tbu)-gly-lys(boc)-cys(trt)-rnikamideam树脂35g。

每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：

fmoc-cys(trt)-oh7.03g，

fmoc-lys(boc)-oh5.62g，

fmoc-gly-oh3.57g，

fmoc-ser(tbu)-oh4.6g，

fmoc-arg(pbf)-oh7.79g，

fmoc-cys(trt)-oh7.03g，

fmoc-ser(tbu)-oh4.6g，

fmoc-gly-oh3.57g，

fmoc-thr(tbu)-oh4.77g，

fmoc-cys(trt)-oh7.03g，

fmoc-cys(trt)-oh7.03g；

每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：hbtu(4.32g)，nmm(2.72ml)；

取上述树脂35g置于500ml烧瓶中，加入350ml裂解液，配比（v%）组成为：87.5%tfa+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，置于摇床中常温震荡反应2小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，加入1400ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段b：cys-cys-thr-gly-ser-cys-arg-ser-gly-lys-cys-nh26.6g，mw：1103，产品质谱图见图2。

实施例7

取实施2中的多肽片段a2.25g和实施例6中的多肽片段b1.65g溶于500mlph7.0pbs溶液中，搅拌反应2小时，ab链耦合得到齐考诺肽线性肽粗品，mw：2645，产品质谱图见图3；再加入10mldmso，继续搅拌氧化反应6小时，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，冻干得到齐考诺肽精品2.4g，mw：2639，纯度99.2%，收率61.5%，精品ms和hplc见图4和图5。

实施例8

取实施3中的多肽片段a2.35g和实施例6中的多肽片段b1.65g溶于500mlph7.5pbs溶液中，搅拌反应1小时，ab链耦合得到齐考诺肽线性肽粗品，再加入25mldmso，继续搅拌氧化反应2小时，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，冻干得到齐考诺肽精品2.5g，纯度99.5%，收率62.5%。

实施例9

取实施2中的多肽片段a2.32g和实施例6中的多肽片段b1.65g溶于500mlph6.5pbs溶液中，搅拌反应2小时，ab链耦合得到齐考诺肽线性肽粗品，再加入10mldmso，继续搅拌氧化反应6小时，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，冻干得到齐考诺肽精品2.3g，纯度99.3%，收率58.0%。

实施例10

取实施2中的多肽片段a2.4g和实施例6中的多肽片段b1.65g溶于500mlph7.0pbs溶液中，搅拌反应2小时，ab链耦合得到齐考诺肽线性肽粗品，再加入15mldmso，继续搅拌氧化反应6小时，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，冻干得到齐考诺肽精品2.6g，纯度99.5%，收率64.19%。