Peroxiredoxin4蛋白增强体外培养卵母细胞抗氧化作用的用途的制作方法

本发明属于辅助生殖、胚胎培养领域。具体的说是涉及peroxiredoxin4蛋白增强体外培养卵母细胞抗氧化作用的用途。

背景技术：

随着年龄增长、病理条件下内环境的改变而导致的氧化应激/ros损伤都将影响卵泡的发育。这是由于在病理状态下，颗粒细胞的氧化应激可导致细胞发生凋亡,影响颗粒细胞的保护及调节功能,从而影响卵子的发育。另一方面，辅助生殖治疗中的体内或体外已然成熟的卵子，在授精之前进行体外培养的过程中，由于氧化应激反应使其老化从而影响卵母细胞质量、影响授精能力和胚胎发育潜能，降低临床妊娠率。

近些年来，胚胎移植技术已在动物引种和改良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转基因和克隆动物实现的应用技术。在体外受精、转基因、克隆以及试管婴儿等胚胎生物技术中，经常会涉及到未成熟卵体外培养成熟（ivm），不同的未成熟卵培养液及培养方法会影响未成熟卵体外培养的成熟率、受精率及临床妊娠率。因此，如何提高未成熟卵体外培养成熟率一直是胚胎培养领域的关注焦点。

现有未成熟卵体外培养成熟技术中，大部分技术焦点在于如何提高未成熟卵母细胞自身成熟率，在基础培养液中添加激素类、血清类及生长因子类(egf)等。但是，目前还没有通过改善卵丘细胞-卵母细胞复合体（coc）颗粒细胞的氧化应激从而提高未成熟卵体外发育成熟的方法。

目前普遍认为卵泡内产生的活性氧（ros）和氧自由基，例如oh、o2以及h2o2，特别是排卵过程中产生的活性氧，不利于卵母细胞发育的。调节卵泡中活性氧和抗氧化剂之间的平衡，对于卵母细胞发育成熟和颗粒细胞功能起着关键作用。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提出一种peroxiredoxin4蛋白增强体外培养卵母细胞抗氧化作用的用途。进一步的，提出一种peroxiredoxin4蛋白在调节体外培养卵母细胞中活性氧和抗氧化之间平衡的用途。

进一步的，提出一种peroxiredoxin4蛋白在抵御颗粒细胞氧化应激导致的细胞凋亡发挥调节作用的用途，进一步的，peroxiredoxin4蛋白通过颗粒细胞内及卵母细胞自身的抗氧化应激机制发挥改善未成熟卵母细胞体外培养成熟的用途。

进一步的，提出一种peroxiredoxin4蛋白在抑制h2o2导致的卵丘扩展指数及卵母细胞mii成熟率下降的用途；以及，peroxiredoxin4蛋白在抑制ros导致的卵丘扩展指数及卵母细胞mii成熟率下降的用途。

进一步的，提出一种peroxiredoxin4蛋白通过细胞内抗氧化应激机制延缓卵母细胞老化的用途，具体的，提出一种peroxiredoxin4蛋白通过颗粒细胞内及卵母细胞自身的抗氧化应激机制延缓卵母细胞老化的用途。

进一步的，本发明还提出一种制备控制卵泡中活性氧和抗氧化剂之间平衡的试剂，该试剂中含有peroxiredoxin4蛋白，还含有体外培养试剂上内允许添加的辅料。。所述试剂为卵母细胞培养液和体外未成熟卵培养液，还包含czb培养液、ksom培养液、mem培养液、htf培养液中的任何一种培养液，是作为基础培养基。以上所述基础培养基皆为本领域技术人员悉知的商品化培养试剂。

进一步的，本发明还提出一种抵御颗粒细胞氧化应激导致的细胞凋亡发挥调节作用的试剂，该试剂的组合物含有peroxiredoxin4蛋白。所述试剂为卵母细胞培养液和体外未成熟卵培养液，还包含czb培养液、ksom培养液、mem培养液、htf培养液中的任何一种培养液，是作为基础培养基。

进一步的，本发明还提出一种抑制卵泡体外培养中外源性活性氧簇（ros）导致的卵丘扩展指数及卵母细胞mii成熟率下降的试剂，该试剂的组合物中含有peroxiredoxin4蛋白。所述试剂为卵母细胞培养液和体外未成熟卵培养液，还包含czb培养液、ksom培养液、mem培养液、htf培养液中的任何一种培养液，是作为基础培养基。

进一步优选的，成熟卵子体外培养、体外未成熟卵培养过程中，所述卵母细胞体外培养液中peroxiredoxin4蛋白的浓度为5-100μg/ml。较佳地，未成熟卵体外培养液中peroxiredoxin4蛋白的浓度为15-25μg/ml。优选地，所述peroxiredoxin4蛋白的浓度为20μg/ml。

进一步的，本发明还提出一种提高未成熟卵细胞体外培养成熟率的培养方法，包括如下步骤：

从物种来源体内取出未成熟卵的步骤；所述物种来源为人类和哺乳动物，哺乳动物包括小鼠、大鼠、猪、牛、羊、或者灵长类动物；

将未成熟卵放置在含有peroxiredoxin4蛋白的培养液中持续培养的步骤；培养的条件为37℃、5%co2和饱和湿度，持续培养的时间为4—24小时，所述未成熟卵的物种来源与所述peroxiredoxin4蛋白的物种来源可以相同，也可以不相同，在物种来源不相同的情况下，两个物种产生的peroxiredoxin4蛋白之间应具有相同或者相似的功能。

进一步的，本发明还提出一种延缓体外培养卵母细胞老化的培养方法，包括如下步骤：

从物种来源体内取出成熟卵子的步骤；所述物种来源为人类和哺乳动物，哺乳动物包括小鼠、大鼠、猪、牛、羊、或者灵长类动物；

将成熟卵子放置在含有peroxiredoxin4蛋白的培养液中持续培养的步骤；培养的条件为37℃、5%co2和和饱和湿度，持续培养的时间为3—6小时直到授精，所述成熟卵子的物种来源与所述peroxiredoxin4蛋白的物种来源可以相同，也可以不相同，在物种来源不相同的情况下，两个物种产生的peroxiredoxin4蛋白之间应具有相同或者相似的功能。

进一步的，本发明还提出：peroxiredoxin4蛋白在体内具有调节颗粒细胞内及卵母细胞自身的活性氧和抗氧化之间平衡、抵御颗粒细胞氧化应激导致的细胞凋亡的作用。本发明的peroxiredoxin4蛋白具有调节颗粒细胞内及卵母细胞自身的活性氧和抗氧化之间平衡、抵御颗粒细胞氧化应激导致的细胞凋亡的作用。peroxiredoxin4蛋白的用途不限于peroxiredoxin4蛋白通过颗粒细胞内及卵母细胞自身的抗氧化应激机制延缓卵母细胞老化的用途，制备控制卵泡中活性氧和抗氧化剂之间平衡的试剂，以及抵御颗粒细胞氧化应激导致的细胞凋亡而发挥调节作用的试剂，还包括peroxiredoxin4蛋白作为药物和药物复方成分的其他用途，应用于促进卵母细胞成熟、延缓卵巢衰老。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种peroxiredoxin4蛋白增强体外培养卵母细胞抗氧化作用的用途。本发明能够从提高颗粒细胞抵御氧化应激能力的角度、以及卵母细胞抗氧化的作用，来改善体外培养未成熟卵母细胞的成熟率，能够通过细胞内抗氧化应激机制延缓卵母细胞老化，提高辅助生殖过程中卵母细胞受精率和临床妊娠率。

关于本发明的优点可以藉由以下的发明详述及所附图式得到进一步的了解。

附图说明

图1为peroxiredoxin4蛋白在胎儿期、成熟期、老年期表达量状况图；其中a/b/c:12h(胎儿期)d/e/f:3w(青春期)g/h/i:8w(成熟期)j/k/l:18m(老年期)c/f/i/l:阴参；

图2为peroxiredoxin4主要表达与小鼠卵巢颗粒细胞中，及随生长发育表达模式图；

图3为peroxiredoxin4在小鼠成熟coc中表达；

图4为peroxiredoxin4在小鼠未成熟coc中表达；

图5为peroxiredoxin4蛋白表达统计学差异分析（p<0.05）；

图6为peroxiredoxin4主要表达与小鼠卵泡颗粒细胞中，并与卵泡发育相关图；其中，a：初级卵泡b：次级卵泡c：窦卵泡d：排卵前卵泡；

图7为peroxiredoxin4蛋白在围绝经期妇女和正常育龄妇女卵巢中的表达差异图；

图8为原代培养小鼠颗粒细胞外源性加入h2o2状况图；

图9a为外源性添加h2o2对卵丘扩展以及卵母细胞mii成熟率影响图；（*，p<0.05；**，p<0.01，均与未添加h2o2组相比）；

图9b为peroxiredoxin4超表达腺病毒在小鼠coc体外培养中的验证结果图（mrna水平）；

图9c为超表达peroxiredoxin4对h2o2导致卵泡发育障碍的作用（a,b组之间比较p<0.05）；

图10为未成熟卵成熟率平均值图。

具体实施方式

实施例1：

本发明提出一种peroxiredoxin4蛋白在调节体外培养卵母细胞中活性氧和抗氧化之间平衡的用途。进一步的，提出一种peroxiredoxin4蛋白在抵御颗粒细胞氧化应激导致的细胞凋亡发挥调节作用的体外培养试剂的用途。进一步的，提出一种peroxiredoxin4蛋白在抑制h2o2导致的卵丘扩展指数及卵母细胞mii成熟率下降的体外培养试剂的用途。

所述体外培养试剂（液）为体外卵母细胞培养液、未成熟卵体外培养成熟（ivm）培养液，除了包含peroxiredoxin4蛋白之外，还包含czb培养液、ksom培养液、htf培养液中的任何一种培养液，是作为基础培养基。以上所述基础培养基皆为本领域技术人员悉知的商品化培养试剂。所述体外卵母细胞培养液中peroxiredoxin4蛋白的浓度为5至100μg/ml，所述peroxiredoxin4蛋白的浓度可以为由这些数值组成的任何浓度区间。较佳地，所述ivm培养液中peroxiredoxin4蛋白的浓度为15-25μg/ml，优选地，所述peroxiredoxin4蛋白的浓度为20μg/ml。

mem培养基（minimumeagle'smedium）是动物细胞培养中的常用培养基，含12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素，主要用于包括卵母细胞在内的哺乳动物细胞的培养。czb培养基是一种可以使多种品系的小鼠受精后胚胎发育至囊胚期的培养基，现己广泛应用于胚胎操作和各种小鼠克隆实验中。htf培养基是一种以kreb’s一ring碳酸盐溶液为基础的着床前胚胎培养基，其成分相当简单，主要包括提供能量的丙酮酸钠、乳酸钠和葡萄糖，并且还包括血清白蛋白。ksom培养基是一种主要用于培养体外授精的小鼠胚胎的培养基，富含必须氨基酸和非必需氨基酸。

在本发明中使用的peroxiredoxin4蛋白可以通过任何方式获得，例如可以通过分离提纯获得或者通过重组或者合成方式生产。举例而言，由转染有小鼠peroxiredoxin4基因并可正常表达peroxiredoxin4蛋白的hek293细胞系（重组蛋白体外细胞表达系统）来生产。从经济的角度上看，所述peroxiredoxin4蛋白优选通过重组方式生产来获得。

本发明还提出一种提高未成熟卵成熟率的培养方法，包括在取出未成熟卵后，在上述未成熟卵母细胞培养液中培养。

所述培养在37℃、5%co2和100％湿度条件下进行，可以持续适当长的一段时间，例如可以持续4一24小时，如4、5、6、7或8小时，优选地持续18小时。

所述未成熟卵可以是任何物种来源的卵母细胞。例如，所述未成熟卵可以是来源于哺乳动物例如小鼠、大鼠、猪、牛、羊、或者灵长类动物例如人的未成熟卵。

所述未成熟卵的物种来源与所述peroxiredoxin4蛋白的物种来源可以相同，也可以不相同。优选地，所述胚胎的物种来源与所述peroxiredoxin4蛋白的物种来源是相同的。在物种来源不相同的情况下，两个物种产生的peroxiredoxin4蛋白之间应具有相同或者相似的功能。

发明人通过实验研究发现在人和小鼠卵巢组织中，peroxiredoxin4蛋白主要定位于颗粒细胞的细胞质内，也存在于卵母细胞胞质内，且与卵巢卵泡发育密切相关，在性成熟期表达量最高，青春期前和老年期表达量均较低。peroxiredoxin4蛋白在卵泡颗粒细胞中，通过抵御颗粒细胞的氧化应激导致的细胞凋亡发挥调节作用；同时，颗粒细胞内peroxiredoxin4通过camp经缝隙连接影响未成熟卵的发育成熟。

westernblot分析后结果显示，与正常育龄妇女卵巢相比，围绝经期妇女卵巢组织中peroxiredoxin4蛋白表达水平显著降低（p<0.05）。

coc培养过程中进行h2o2处理的同时加入peroxiredoxin4超表达腺病毒，发现将卵丘细胞中peroxiredoxin4超表达同ros清除剂tiron相似，可抑制h2o2导致的卵丘扩展指数及卵母细胞mii成熟率下降。结果证实ros过量导致的卵丘扩展指数及卵母细胞mii率下降，可通过将卵丘细胞内peroxiredoxin4超表达进而清除ros改善。

如图1所示，发明人通过实验研究发现在人和小鼠卵巢组织中，peroxiredoxin4蛋白主要定位于颗粒细胞的细胞质内，且与卵巢卵泡发育密切相关，在性成熟期表达量最高，青春期前和老年期表达量均较低。

如图3-5所示，发明人通过对小鼠未成熟卵母细胞-卵丘复合体与成熟卵母细胞-卵丘复合体蛋白谱图差异比对，发现peroxiredoxin4为差异蛋白，并且在成熟卵母细胞-卵丘复合体中表达含量明显上调（p<0.05）。说明peroxiredoxin4与卵泡发育、卵母细胞成熟密切相关。

如图6所示，发明人通过免疫组化实验发现，peroxiredoxin4与小鼠卵泡发育相关，在初始卵泡颗粒细胞中表达较低，随卵泡发育增加，至窦卵泡及排卵前卵泡颗粒细胞中最多。提示我们peroxiredoxin4表达与卵泡发育相关。

如图7所示，westernblot分析后结果显示，与正常育龄妇女卵巢相比，围绝经期妇女卵巢组织中peroxiredoxin4蛋白表达水平显著降低（p<0.05）。说明peroxiredoxin4与年龄因素导致的卵泡发育不良相关。

如图8所示，通过原代培养小鼠颗粒细胞，发现外源性加入h2o2，可导致细胞凋亡增多，凋亡因子水平显著升高。说明h2o2的累积导致颗粒细胞凋亡进而影响卵母细胞的成熟。

为了体外实验验证外源性h2o2模拟ros累积对卵泡发育的影响，如图9a所示，外源性添加h2o2对卵丘扩展以及卵母细胞mii成熟率影响（*，p<0.05；**，p<0.01，均与未添加h2o2组相比），在体外培养coc过程中，加入不同剂量h2o2（0，100μm，200μm，400μm，800μm，1000μm），观察卵泡发育中两个重要指标：卵丘扩展指数及卵母细胞mii成熟率。发现h2o2可剂量依赖性抑制coc卵丘扩展指数及卵母细胞mii形成率，且在h2o2为100μm时即有统计学差异（p<0.05），在h2o2为400μm时有显著性差异（p<0.01）。

peroxiredoxin4超表达腺病毒在小鼠卵母细胞卵丘复合体coc体外培养成熟中验证结果，提示其提高了外层卵丘细胞内peroxiredoxin4的表达。如图9b所示，peroxiredoxin4超表达腺病毒在小鼠coc体外培养中的验证结果（mrna水平），control：正常细胞；ad-gfp：腺病毒空载体组；ad-peroxiredoxin4：腺病毒peroxiredoxin4超表达组（**，表示和ad-gfp组相比p<0.01）；利用构建完成的peroxiredoxin4超表达腺病毒，在小鼠coc中进行验证，发现构建的peroxiredoxin4超表达腺病毒可3倍以上增加卵丘细胞内peroxiredoxin4基因表达，且在感染coc过程中，只能够感染外层卵丘细胞，而不影响卵母细胞内peroxiredoxin4的基因表达。

超表达卵丘细胞内peroxiredoxin4改善ros累积导致卵泡发育障碍提高了卵母细胞成熟率。如图9c所示，超表达peroxiredoxin4对h2o2导致卵泡发育障碍的作用（a,b组之间p<0.05），未成熟卵母细胞体外培养过程中产生的ros导致体外培养成熟率下降。如图9c所示，ros过量导致的卵丘扩展指数及卵母细胞mii率下降，可通过将卵丘细胞内peroxiredoxin4超表达进而清除ros改善。

如图10所示，卵泡体外培养中未添加peroxiredoxin4蛋白的组1成熟率为0.3225，添加peroxiredoxin4蛋白的组2成熟率为0.435（p<0.05）。添加peroxiredoxin4蛋白的组2未成熟卵的成熟率明显高于组1。由此，可见添加peroxiredoxin4蛋白明显提高未成熟卵母细胞的体外成熟率。

实施例2：为了更好的理解本发明，本发明人将具体实验过程及实验数据描述如下：

1.采用的主要仪器和设备

移液器：eppendorf；

co2培养箱：forma521；

倒置相差显微镜：尼康1000；

超净工作台：苏净；

体视显微镜：尼康2000；

加热平台：国产；

培养皿；

1.主要试剂

peroxiredoxin4蛋白：购自abcam公司。

组1ivm液中未添加peroxiredoxin4蛋白；

组2ivm液中添加peroxiredoxin4蛋白20ug/ml；

将正常雌性icr小鼠用电离辐照4gy后，人为造成卵巢组织衰老。

按下述步骤实验：

icr雌性小鼠注射5iu的pmsg。

48h后杀鼠取双侧卵巢置于体外受精培养液中（预热30分钟），剥去卵巢胞膜，细针戳碎卵巢至破棉絮状，以释放卵丘卵母细胞复合体（cocs）。卵丘细胞紧密包裹在卵子周围。

3.制备ivm培养皿，小皿中制ivm培养滴30ul/滴，上盖2ml矿物油防蒸发。37℃,5%co2培养箱中平衡2h。

4.镜下口吸管吸取gv期cocs，置于ivm培养滴中，37℃,5%co2培养箱中培养16~18小时。

5.培养后机械性剥除卵丘细胞（ccs）即可见成熟的mii期卵母细胞（排出完整第一极体），计算成熟率。

如图10所示，组1成熟率为32.25%，组2成熟率为43.5%（p<0.05）。添加peroxiredoxin4蛋白的组2未成熟卵的成熟率明显高于组1。从图10中可以看出，组1成熟率为0.3225，组2成熟率为0.435（p<0.05）。添加peroxiredoxin4蛋白的组2未成熟卵的成熟率明显高于组1。由此，可见添加peroxiredoxin4蛋白明显提高未成熟卵母细胞的体外成熟率。