检测莲草直胸跳甲EF基因表达特性的引物及方法与流程

本发明涉及一种检测莲草直胸跳甲ef基因表达特性的荧光定量pcr引物，属于生物技术领域。

背景技术

莲草直胸跳甲属鞘翅目，叶甲科，是空心莲子草的主要生防天敌之一。georgevogt于1962年首次发现了莲草直胸跳甲对空心莲子草有很好的控制作用。其后，莲草直胸跳甲在美国、澳大利亚等地被广泛应用于空心莲子草的控制，并取得了较好的防治效果。我国于1986年从美国引进莲草直胸跳甲，并应用于空心莲子草的生物防治，在四川、浙江、福建、广西等地取得一定的成功。

延伸因子(elongationfactor，ef)是参与蛋白合成过程中肽链延伸的蛋白因子，在所有多细胞生物体的新陈代谢过程中发挥着重要的作用，它包括延伸因子ef-1和延伸因子ef-2。延伸因子ef-1由α、β、γ和δ等4个亚基组成，是细胞内普遍存在且大量表达的多聚核糖体蛋白质，在基因表达和翻译过程中起重要的作用。ef-2是真核生物蛋白质合成时肽链延伸过程中必不可少的蛋白因子，它能催化gtp水解，使肽酰-trna从核糖体的氨酰基位点移到肽基位点，从而使核糖体沿着mrna运动以完成转录过程。因此，ef的正常表达关系到机体细胞的生长及蛋白质的合成，ef通过不断改变其在细胞内的表达量，以调节总蛋白质的合成，在不同机制作用下，ef的活性和表达量也会发生改变。

研究表明在甲壳动物养殖生产中，水体环境中的应激因素可以引起广泛的细胞损伤，包括dna损害、脂质过氧化作用以及蛋白质氧化等，最终导致ef的表达量发生变化。罗淋淋等（2014）测定了不同杀虫剂作用于松墨天牛ef基因，导致其均有不同程度的上调表达，说明松墨天牛产生了自我保护反应。生物有机体细胞适应环境压力的能力是它们生存的关键，生物体在进化过程中使其对环境和生理压力具有一定的应答能力，许多应答的共同特点是选择性调节基因的转录和翻译，包括允许可逆基因的快速表达。目前研究表明环境压力可诱导ef基因的表达，从而调节蛋白质合成以应对环境条件的变化。

关于莲草直胸跳甲ef基因的表达等研究国内外未见报道，因此采用实时荧光定量pcr研究不同co2浓度处理下莲草直胸跳甲ef基因的表达特性，结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫ef基因的表达量均升高，这与转录组表达量上调的变化趋势一致，说明co2浓度升高可以影响ef基因的表达调控。本研究旨在了解ef基因在不同co2浓度处理后的反应，为后续研究莲草直胸跳甲ef基因的具体功能与环境胁迫之间的作用机制提供理论依据。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效快捷检测莲草直胸跳甲ef基因表达量的实时荧光定量pcr引物及方法。

本发明的另一目的是为全面了解莲草直胸跳甲ef基因的表达特性而设计的不同处理co2浓度。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

将取食不同co2浓度培育的空心莲子草的莲草直胸跳甲雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。

设计一对检测莲草直胸跳甲ef基因表达特性的引物，其特征包括符合荧光定量pcr反应特点的上下游引物：

ef-f：5`-taccacgctcacgctcag-3`

ef-r：5`-cggcaagtccaccacaac-3`

以及作为内参基因的上下游引物：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

本发明所述检测莲草直胸跳甲ef基因表达特性的荧光定量pcr法，其特征按如下步骤进行：

（1）cdna第一链合成：提取样本的总rna并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的rna为模板反转录得到的cdna；

（2）对下述引物进行常规pcr检测

该基因的荧光定量上下游引物：

ef-f：5`-taccacgctcacgctcag-3`

ef-r：5`-cggcaagtccaccacaac-3`

以及作为内参基因的上下游引物：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

常规pcr扩增体系如下：

常规pcr反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；

（3）实时荧光定量pcr反应：

以步骤（1）得到的cdna为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量pcr反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。

实时荧光定量pcr扩增体系如下：

实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

本发明更加详细的试验方法如下：

莲草直胸跳甲ef基因的实时荧光定量pcr检测方法可通过以下步骤实现：

（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲ef基因的序列，使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

ef-f：5`-taccacgctcacgctcag-3`

ef-r：5`-cggcaagtccaccacaac-3`

同时，根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量pcr内对照物的引物，引物序列如下：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

（2）莲草直胸跳甲处理试验：在对照co2浓度（420μl·l^－1）和高co2浓度（750μl·l^－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同co2浓度的雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。

（3）cdna第一链合成：参照全式金公司的transzol^tmupplusrnakit试剂盒说明书提取总rna，按照transscript公司的one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书，合成cdna第一链。

（4）实时荧光定量pcr反应：实时荧光定量pcr采用takara公司的sybr^®premixextaq^tm试剂盒进行。以上述合成的cdna第一链为模板，上述ef-f、ef-r和tubulin-f、tubulin-r为特异性引物，进行荧光定量pcr程序，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行ct值的平均数。

实时荧光定量pcr扩增体系如下：

实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

（5）莲草直胸跳甲ef基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mrna表达=2^-δδct×100%，其中ct值=靶基因ct值-tubulinct值。

（6）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同co2浓度培育的空心莲子草后ef基因的差异表达。结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫ef基因的表达量均升高，并与转录组的表达量变化趋势一致，这为我们深入开展莲草直胸跳甲ef基因的研究提供了重要的基础数据。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明中的不同co2浓度处理措施，对昆虫绝大部分延伸因子基因都适用，这对全面深入研究基因表达特性具有重要的意义。

（2）本发明所述高效快捷的荧光定量pcr法，包括荧光定量pcr程序等，实际用时50min，相对于现有技术大大缩短了反应时间，具有高效快捷的特性。

（3）本发明所述的荧光定量pcr法，提供常规pcr电泳结果图，可以直观快捷的反映出引物的特异性。

附图说明

附图为莲草直胸跳甲雌雄虫ef基因转录水平的荧光定量pcr检测结果。

图1：莲草直胸跳甲ef基因荧光定量引物常规pcr产物电泳结果：产物长度为158bp，

marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。

图2：莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量引物常规pcr产物电泳结果：产物长度为199bp，marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。

图3：莲草直胸跳甲雌虫（f）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后ef基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。

图4：莲草直胸跳甲雄虫（m）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后ef基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。

具体实施方案

以下结合具体实施例及附图说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制发明，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

试验材料的处理

在对照co2浓度（420μl·l^－1）和高co2浓度（750μl·l^－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同co2浓度的雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。

实施例2

引物的设计

（1）引物设计：根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲ef基因的序列，使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

ef-f：5`-taccacgctcacgctcag-3`

ef-r：5`-cggcaagtccaccacaac-3`

莲草直胸跳甲ef基因荧光定量pcr产物长度为158bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量pcr检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

（2）同时，根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量pcr内对照物的引物，引物序列如下：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量pcr产物长度为199bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量pcr检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。

实施例3

总rna的提取

参照全式金公司的transzol^tmupplusrnakit试剂盒说明书提取总rna，用液氮将虫体研磨成粉，加入1mltranszol^tmup，转到1.5ml转离心管中，室温静置5min后，加入200μl氯仿/1mltranszol^tmup，剧烈振荡30s，室温孵育3min。4℃10000g离心15min后，移上层水相（一般<80%）于新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。将rna离心柱套于2ml收集管中，将上步混合物全部转入离心柱中，12000g，30~60s离心，弃流动相，重复使用收集管。加入500μlcb9，室温12000g离心30s，弃流动相，再加入500μlcb9，室温12000g离心30s，弃流动相。加入稀释的500μlwb9，12000g离心30s，弃流动相，再加入稀释的500μlwb9，12000g离心30s，弃流动相。12000g离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入rnase-freetube中，加50μlrnase-freewater在离心柱的中央，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱rna。所得的rna置于-80℃备用。

实施例4

cdna第一链合成：按照transscript公司的one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书步骤，以实施例3中的rna为模板，反转录生成cdna第一链，具体步骤如下：

（1）反转录体系

（2）42℃温育30min。

（3）85℃加热5min，产物可放在-20℃、-80℃保存。

实施例5

进行荧光定量pcr反应。实时荧光定量pcr采用takara公司的sybr^®premixextaq^tm试剂盒进行。以实施例4中的cdna为模板，用实施例2中的引物进行实时荧光定量pcr扩增反应，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行ct值的平均数。

（1）实时荧光定量pcr扩增体系如下：

（2）实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

（3）实时荧光定量pcr完成后，根据ct值计算不同处理条件下相对表达量的比值2^-δδct。莲草直胸跳甲ef基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mrna表达=2^-δδct×100%，其中ct值=靶基因ct值-tubulinct值。

表1：莲草直胸跳甲雌虫（f）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后ef基因的c(t)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量

表2：莲草直胸跳甲雄虫（m）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后ef基因的c(t)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量

（4）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同co2浓度培育的空心莲子草后ef基因的差异表达。结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫ef基因的表达量均升高，与转录组的表达量上调的变化趋势一致。这为我们深入开展莲草直胸跳甲ef基因的研究提供了重要的基础数据。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>检测莲草直胸跳甲ef基因表达特性的引物及方法

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