本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌等弯曲菌的快速分离纯化培养方法。
背景技术
弯曲菌病原名孤菌病，是由弯曲菌引起的人和动物多种疾病的总称。各种动物（特别是猪、鸡、牛、羊）都能患病，除可引起腹泻外，还可造成牛、羊和犬的流产、不孕、乳房炎及禽类的传染性肝炎等疾病。对人除可引起腹泻和食物中毒外，也可造成流产、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎和脑膜炎等全身性感染。近年来，国内外从动物和人类分离到弯曲菌的报道日益增多。该病在世界各地的分布较广。目前该病已作为重要的人兽共患病而引起广泛重视。
引起动物和人类疾病的主要是空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌。弯曲菌的菌体纤细，呈螺旋形、撇行、s形和鸥形等多种形态。在老龄培养物中呈螺旋状长丝或圆球形，运动力活泼。革兰氏染色阴性，微需氧，对营养要求较高。在含10%二氧化碳的环境中生长良好，于培养基内添加血液、血清有利于初代的培养。
研究表明弯曲菌能产生细胞膨胀致死毒素，其有三个亚型，即a型，b型和c型。细胞膨胀致死毒素与弯曲菌致病性、出血性腹泻、食物中毒、食品安全密切相关。动物感染弯曲菌后，可随粪便排菌，也可通过牛乳和其他分泌物排出，造成污染。猪、禽在宰杀和加工过程中肉品被污染，容易引起暴发。鸡和猪肠道中带菌率相当高，特别是鸡，可达50%-90%，已成为本病流行病学的一个重要问题。禽类感染本菌主要引起肝炎变化。
雏鸡感染后常表现精神沉郁和腹泻。病的严重程度取决于鸡的日龄和菌株的毒力，环境应激因素可加重病情。剖检变化主要是肠管鼓胀，肠腔积有黏液和水样内容物，如病菌毒力腔，可能见到出血变化。开产前后的母鸡感染后表现精神沉郁，体重减轻，鸡冠发白、干燥、萎缩，常有腹泻，产蛋率下降25%-35%，病死率一般为2%-15%。死后剖检最明显的病理变化是肝肿大、褪色，有星状黄色小坏死灶散播于整个肝实质内，肝被膜下有大小不等的出血灶，严重者肝变脆，并满布菜花样大坏死灶区；慢性病例肝变硬并萎缩，常伴有腹水或心包积液。由于鸡肝脏发生炎症和坏死，又称为鸡弯曲菌性肝炎或鸡传染性肝炎。
人感染后，潜伏期一般为3-5d,病情轻重不一。典型病人先有发热，全省无力，头痛，肌肉酸痛，婴儿还可发生抽搐临诊症状。继而腹痛，常局限于脐周，呈间歇性，有的呈隐痛，排便后可缓解。发热12-24h后开始腹泻，呈水样，每天排便5-10次，1-2d后部分病例出现黏液便或脓血便，经过1周可自行缓解，少数病例腹痛可持续数周，反复发生腹泻。近年来，弯曲菌常引起儿童肠道外感染，如败血症、脑膜炎、胆囊炎、腹膜炎、心内膜炎、血栓性静脉炎和反应性关节炎等。
根据流行病史和临诊表现可怀疑为本病，确诊需进行细菌的分离鉴定。但弯曲杆菌分离较为困难，生长缓慢，往往不容易分离到，不利于养殖户和规模化企业采取相应的措施和药物来进行及时的预防和治疗。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于提供一种用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法，本方法操作简便、省工省时，可以提高弯曲菌的分离效率，为弯曲菌病原临床诊断和检测提供技术支持和理论基础。
为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：一种用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法，包括以下步骤：
（1）目的样品的采集：无菌采集动物粪便病料0.1g-0.5g，装入0.5-1ml的pbs液中备用。
（2）分离纯化培养：
①取含有目的样品的pbs液0.5-0.8ml加到过滤器1中，所述过滤器1的滤膜厚度为25-35µm，将过滤器1放入到收集器1中，以11000rpm-13000rpm的转速离心0.5-2min；
②将过滤器1中的滤液取出放入到过滤器2中，所述过滤器2的滤膜厚度为5µm，将过滤器2放入到收集器2中，以11000rpm-13000rpm的转速离心0.5-2min；
③取过滤器2中的液体5-20µl均匀涂于平板培养基中培养24-48h,培养温度为40-45℃；
④从平板培养基中挑取单菌落接种至纯化培养基中进行纯化，纯化时间为24-48h，纯化温度为40-45℃；
⑤从纯化培养基中提取细菌基因组dna，进行分子诊断，扩增出目的基因片段，即可判定为弯曲菌。
基于上述技术方案，所述平板培养基的制备工艺为：首先准备原料：酪蛋白胰酶消化物22-24g，淀粉0.8-1.2g，氯化钠4-6g，琼脂粉14-18g，磷酸氢二钾0.8-1.3g，乳糖8-12g，酵母浸膏4-6g，蒸馏水800-1200ml；将原料混匀溶解，115-140℃高压灭菌12-20min，冷却至40-60℃，加入40-60ml无菌脱纤维羊血，混匀制成平板。
基于上述技术方案，所述平板培养基的准备工艺为：首先准备原料：酪蛋白胰酶消化物23g，淀粉1g，氯化钠5g，琼脂粉16g，磷酸氢二钾1g，乳糖10g，酵母浸膏5g，蒸馏水1000ml；将原料混匀溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃，加入50ml无菌脱纤维羊血，混匀制成平板。
基于上述技术方案，所述纯化培养基的制备工艺为：首先准备原料：酪蛋白胰酶消化物22-24g，淀粉0.8-1.2g，氯化钠4-6g，琼脂粉14-18g，磷酸氢二钾0.8-1.3g，乳糖8-12g，酵母浸膏4-6g，蒸馏水800-1200ml；将原料混匀溶解，115-140℃高压灭菌12-18mi，冷却至45-60℃，加入45-65ml无菌脱纤维羊血，多粘菌素b80000-120000iu，新生霉素1-3mg，放线菌酮15-25mg，混匀制成平板。
基于上述技术方案，所述纯化培养基的制备工艺为：首先准备原料：酪蛋白胰酶消化物23g，淀粉1g，氯化钠5g，琼脂粉16g，磷酸氢二钾1g，乳糖10g，酵母浸膏5g，蒸馏水1000ml；将原料混匀溶解，121℃高压灭菌15mi，冷却至50℃，加入50ml无菌脱纤维羊血，多粘菌素b100000iu，新生霉素2mg，放线菌酮20mg，混匀制成平板。
基于上述技术方案，所述动物粪便为结肠粪便、空肠粪便或者胎儿粪便。
基于上述技术方案，目的样品的采集：用肛拭子采集动物粪便病料0.1g-0.5g，装入0.5-1ml的pbs液中备用。
基于上述技术方案，所述过滤器1的滤膜厚度为30µm。
基于上述技术方案，分离纯化培养中优选方案为：①取含有目的样品的pbs液0.5ml加到过滤器1中，过滤器1的滤膜厚度为30µm，将过滤器1放入收集器1中，以12000rpm转速离心1min；
②将过滤器1中的滤液取出放入到过滤器2中，过滤器2的滤膜厚度为5µm，将过滤器2放入收集器2中，12000rpm离心1min。
本发明具备如下有益效果：本发明提供了一种用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法，该分离纯化培养方法能快速、准确的分离纯化出弯曲菌。本发明可对弯曲菌感染的单个样品分离纯化，也可对临床病例中混合感染的多个样品分离纯化，可用于弯曲菌病原普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和监测。
本发明的方法建立在快速分离纯化培养方法基础上，大大提高了检测的准确度，降低假阳性的出现几率，特异性较强，省时省力，大大提高了工作效率。
本发明特别适合于弯曲菌的大量临床样本的快速分离纯化培养，可以为临床和科研上弯曲菌病防治和治疗提供科学依据，而且对提高弯曲菌病原的检测、监控、疫苗研制等具有重要意义。
本发明方法适合于从动物粪便等复杂基质中对弯曲菌进行分离纯化，提高样品中弯曲菌的分离率和检出率。可避免因用添加抗生素类药物的选择性培养基而造成弯曲菌难分离及分离率低等难题。与目前常用的方法相比，该方法可以同时处理大批量样品，可以批量检测，具有广阔的市场应用前景和较大的经济效益。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，以便更好地理解本发明技术方案。
实施例1：一种用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法，具体包括以下步骤：
（1）目的样品的采集：
①病料：用肛拭子无菌采集动物空肠粪便病料0.3g，装入0.8ml的pbs液中备用。
（2）分离纯化培养
①取含有目的样品的pbs液0.5ml加到过滤器1中，过滤器1的滤膜厚度为30µm，然后将过滤器1放入收集器1中，以12000rpm的转速离心1min；过滤器1的作用是滤出样品中的大分子杂质，比如盐类物质，培养基中的成分，样品中的大分子物质，只保留了弯曲菌。本实施例中过滤器1的滤膜厚度为30µm，凡是超过30µm的物质均被截留。
②将过滤器1中的滤液取出放入过滤器2中，过滤器2的滤膜厚度为5µm，将过滤器2放入到收集器2中，以12000rpm的转速离心1min；过滤器2的作用是滤出样品中的大于5µm的杂质，只保留弯曲菌。本实施例中过滤器2的滤膜厚度为5µm，而弯曲菌为革兰氏阴性，菌体纤细，大小为0.2~0.5µm×0.5~5.0µm,故可保留弯曲菌。
③取过滤器2中的液体10µl均匀涂于平板培养基中培养60h，培养温度为42℃。
④从平板培养基中挑取单菌落接种至纯化培养基中进行纯化，纯化时间为35h，纯化温度为42℃；
⑤提取纯化后的细菌基因组dna，进行分子诊断，扩增出目的基因片段，即可判定为弯曲菌。
本实施例中平板培养基成分为：酪蛋白胰酶消化物23g，淀粉1g，氯化钠5.g，琼脂粉16g，磷酸氢二钾1g，乳糖10g，酵母浸膏5g，蒸馏水1000ml，将上述成分混匀溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右，加入50ml无菌脱纤维羊血，混匀制成平板。该平板培养基与现有培养基相比：现有培养基成分一般为：酪蛋白胰酶消化物，淀粉，氯化钠，琼脂粉，羊血组成，培养时间需要48~72h，而本实施例平板培养基在现有培养基的基础上增加了磷酸氢二钾，乳糖，酵母浸膏，使培养基更加丰富，细菌生长速度也较快，缩短培养时间至24~36h。
本实施例中纯化培养基成分为：酪蛋白胰酶消化物23g，淀粉1g，氯化钠5.g，琼脂粉16g，磷酸氢二钾1g，乳糖10g，酵母浸膏5g，蒸馏水1000ml，将上述成分混匀溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右，加入50ml无菌脱纤维羊血、多粘菌素b100000iu、新生霉素2mg，放线菌酮20mg；混匀制成平板。该纯化培养基与现有纯化培养基相比：现有纯化培养基成分一般为：酪蛋白胰酶消化物，淀粉，氯化钠，琼脂粉，羊血，多粘菌素b组成，培养时间需要48~72h，本实施例纯化培养基在现有培养基的基础上增加了新生霉素和放线菌酮，抑制了其它细菌的生长，使培养出的弯曲菌更加纯化。
实施例2：一种用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法，具体包括以下步骤：
（1）目的样品的采集：
①病料：用肛拭子无菌采集动物胎儿粪便病料0.1g，装入0.5ml的pbs液中备用。
（2）分离纯化培养
①取含有目的样品的pbs液0.6ml加到过滤器1中，过滤器1的滤膜厚度为25µm，然后将过滤器1放入收集器1中，以11000rpm的转速离心0.5min；过滤器1的作用是滤出样品中的大分子杂质，比如盐类物质，培养基中的成分，样品中的大分子物质，只保留了弯曲菌。过滤器1的滤膜厚度为25µm，凡是超过30µm的物质均都被截留。
②将过滤器1中的滤液取出放入过滤器2中，过滤器2的滤膜厚度为3µm，将过滤器2放入到收集器2中，以11000rpm的转速离心0.5min；由于弯曲菌为革兰氏阴性，菌体纤细，大小为0.2~0.5µm×0.5~5.0µm。过滤器2的滤膜厚度为5µm，可以滤出样品中的大于5µm的杂质，只保留弯曲菌。凡是超过5µm的物质都被截留掉。
③取过滤器2中的液体5µl均匀涂于平板培养基中培养48h，培养温度为45度；
④从平板培养基中挑取单菌落接种至纯化培养基中进行纯化，纯化时间为48h，纯化温度为45度；
⑤提取纯化后的细菌基因组dna，进行分子诊断，扩增出目的基因片段，即可判定为弯曲菌。
本实施例中平板培养基成分为：酪蛋白胰酶消化物24g，淀粉1.2g，氯化钠4g，琼琼脂粉14g，磷酸氢二钾0.8g，乳糖12g，酵母浸膏6g，蒸馏水1200ml，将上述成分混匀溶解，140℃高压灭菌18min，冷却至60℃，加入60ml无菌脱纤维羊血，混匀制成平板。该平板培养基与现有培养基相比：现有培养基成分一般为：酪蛋白胰酶消化物，淀粉，氯化钠，琼脂粉，羊血组成，培养时间需要48~72h，而本实施例培养基在现有培养基的基础上增加了磷酸氢二钾，乳糖，酵母浸膏，使培养基更加丰富，细菌生长速度也较快，缩短培养时间至24~36h。
本实施例中纯化培养基成分为：酪蛋白胰酶消化物24g，淀粉1.2g，氯化钠4g，琼琼脂粉14g，磷酸氢二钾0.8g，乳糖12g，酵母浸膏6g，蒸馏水1200ml，将上述成分混匀溶解，140℃高压灭菌15min，冷却至60℃，加入65ml无菌脱纤维羊血、多粘菌素b120000iu、新生霉素1mg，放线菌酮25mg；混匀制成平板。该纯化培养基与现有纯化培养基相比：现有纯化培养基成分一般为：酪蛋白胰酶消化物，淀粉，氯化钠，琼脂粉，羊血，多粘菌素b组成，培养时间需要48~72h，本实施例纯化培养基在现有培养基的基础上增加了新生霉素和放线菌酮，抑制了其它细菌的生长，使培养出的弯曲菌更加纯化。
实施例3：一种用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法，具体包括以下步骤：
（1）目的样品的采集：
①病料：无菌采集动物结肠粪便病料0.5g，装入1ml的pbs液中备用。
（2）分离纯化培养
①取含有目的样品的pbs液0.8ml加到过滤器1中，过滤器1的滤膜厚度为35µm，然后将过滤器1放入收集器1中，以13000rpm的转速离心2min；过滤器1的作用是滤出样品中的大分子杂质，比如盐类物质，培养基中的成分，样品中的大分子物质，只保留了弯曲菌。过滤器1的滤膜厚度为35µm，凡是超过35µm的物质都被截留了。
②将过滤器1中的滤液取出放入过滤器2中，过滤器2的滤膜厚度为5µm，将过滤器2放入到收集器2中，以13000rpm的转速离心2min；由于弯曲菌为革兰氏阴性，菌体纤细，大小为0.2~0.5µm×0.5~5.0µm。过滤器2的滤膜厚度为5µm，可以滤出样品中的大于5µm的杂质，只保留弯曲菌。凡是超过5µm的物质都被截留掉。
③取过滤器2中的液体20µl均匀涂于平板培养基中培养24h，培养温度为40℃；
④从平板培养基中挑取单菌落接种至纯化培养基中进行纯化，纯化时间为24h，纯化温度为40℃；
⑤提取纯化后的细菌基因组dna，进行分子诊断，扩增出目的基因片段，即可判定为弯曲菌。
本实施例中平板培养基成分为：酪蛋白胰酶消化物22g，淀粉0.8g，氯化钠6g，琼脂粉14g，磷酸氢二钾1.3g，乳糖8g，酵母浸膏4g，蒸馏水800ml，将上述成分混匀溶解，115℃高压灭菌18min，冷却至40℃，加入40ml无菌脱纤维羊血，混匀制成平板。该平板培养基与现有培养基相比：现有培养基成分一般为：酪蛋白胰酶消化物，淀粉，氯化钠，琼脂粉，羊血组成，培养时间需要48~72h，而本实施例培养基在现有培养基的基础上增加了磷酸氢二钾，乳糖，酵母浸膏，使培养基更加丰富，细菌生长速度也较快，缩短培养时间至24~36h。
本实施例中纯化培养基的成分为：酪蛋白胰酶消化物22g，淀粉0.8g，氯化钠6g，琼脂粉14g，磷酸氢二钾1.3g，乳糖8g，酵母浸膏4g，蒸馏水800ml，将上述成分混匀溶解，115℃高压灭菌18min，冷却至45℃，加入45ml无菌脱纤维羊血、多粘菌素b80000iu、新生霉素3mg，放线菌酮15mg；混匀制成平板。该纯化培养基与现有纯化培养基相比：现有纯化培养基成分一般为：酪蛋白胰酶消化物，淀粉，氯化钠，琼脂粉，羊血，多粘菌素b组成，培养时间需要48~72h，本实施例纯化培养基在现有培养基的基础上增加了新生霉素和放线菌酮，抑制了其它细菌的生长，使培养出的弯曲菌更加纯化。
实施例4：对本发明弯曲菌分离纯化效果的试验如下：
1.以猪结肠粪便为样品，分别采用传统分离纯化方法和本发明分离纯化方法进行试验，以弯曲菌分离率为判断依据，所得试验结果见表1.
表1猪结肠粪便弯曲菌分离率
2.以鸡肛拭纸为样品，分别采用传统分离纯化方法和本发明分离纯化方法进行试验，以弯曲菌分离率为判断依据，所得试验结果见表2.
表2鸡肛拭纸弯曲菌分离率
由表1和表2可知，与传统分离纯化培养方法相比，采用本发明的分离纯化培养方法对猪结肠粪便弯曲菌及鸡肛拭纸弯曲菌进行分离，pcr鉴定数及分离率均明显高于传统分离方法，pcr鉴定数及分离率分别相当于传统分离方法的2-3倍。
最后需要说明的是：以上所述为本发明的较佳实例，并非对本发明保护范围的限定，凡依本发明申请专利范围内所做的等同变化与修饰，皆应属于本发明的保护范围。