检测结核杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及检测结核杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的试剂盒。

背景技术：

结核病是危害国民健康的重大传染病，我国是主要的结核病发病大国之一。由于结核分枝杆菌复合群(mycobacteriumtuberculosiscomplex,mtbc)的特殊性，其检测和治疗一直是制约人类攻克结核病的瓶颈。结核病的传统诊断方法是基于培养技术，一般培养需要3～4周才能得到结果；即使是最先进的液体培养技术，也需要10天左右才能得到检查结果；这给结核病的筛查、确诊带来严峻挑战。

随着分子检测技术的出现，因其卓越的灵敏度和特异性表现，其为结核病的筛查和诊断提供了有利的工具。近年来，越来越多的报道显示我国的结核病发病率虽然得到了一定控制，但结核病的诊疗负担一直非常严重。另外，非典型结核分枝杆菌的检出率呈逐年递增的态势，鸟-胞内分枝杆菌复合群(mycobacteriumavium-intracellularecomplex，mac)是主要的非典型结核分枝杆菌复合群，特别是hiv合并感染者，鸟分枝杆菌阳性检出率高居非典型分枝杆菌的首位。

结核分枝杆菌复合群因其高传染风险和严重的感染危害，要求我们开发出一种简便有效并且可以避免操作风险的检测系统；而非典型结核分枝杆菌，特别是鸟-胞内分枝杆菌复合群的检出率的逐年上升，其临床症状与结核分枝杆菌复合群感染相似，且对一线结核药物呈耐药性，因此要求我们开发出一种可以检测并区分结核分枝杆菌复合群和非典型结核分枝杆菌病原体感染的检测试剂。

基于以上重要的现实问题，我们开发一种简便、安全、有效和廉价的检测试剂。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术不足，而提供以单链杂交技术为基础的检测结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的杂交膜条和试剂盒，该杂交膜条和试剂盒能简便、安全和有效检测出结核分枝杆菌复合群和/或鸟-胞内分枝杆菌复合群。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测结核分枝杆菌复合群的mtbc扩增引物对，mtbc扩增引物对的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，mtbc扩增引物对的正向引物5’端还连接有如seqidno.3所示的标签序列，mtbc扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物，第一显色标记物能与结合有微球的第二显色标记物相连接，微球富集后显色。

优选地，mtbc扩增引物对的正向引物和反向引物是相对的，若其中一个为正向引物，另一个则是反向引物。

作为上述技术方案的改进，第一显色标记物为生物素，第二显色标记物为链霉亲和素，微球为富集后显示蓝色的乳胶微球。

另外，本发明还提供一种用于检测鸟-胞内分枝杆菌复合群的第二检测扩增引物对，mac扩增引物对的序列如seqidno.4和seqidno.5所示，mac扩增引物对的正向引物5’端还连接有如seqidno.6所示的标签序列，mac扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物，第一显色标记物能与结合有微球的第二显色标记物相连接，微球富集后显色。

优选地，mac扩增引物对的正向引物和反向引物是相对的，若其中一个为正向引物，另一个则是反向引物。

作为上述技术方案的改进，第一显色标记物为生物素，第二显示标记物为链霉亲和素，微球为富集后显示蓝色的乳胶微球。

另外，本发明还提供用于检测结核分枝杆菌复合群和/或鸟-胞内分枝杆菌复合群的杂交膜条，杂交膜条包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上至少附着有以下一种探针：mtbc检测探针的序列如seqidno.10所示，mac检测探针的序列如seqidno.11所示。

优选地，杂交膜条附着有两条探针：mtbc检测探针的序列如seqidno.10所示，mac检测探针的序列如seqidno.11所示，可用于同时检测结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群。

作为上述技术方案的改进，硝酸纤维膜上还附着有质控探针，质控探针的序列如seqidno.12所示。

作为上述技术方案的进一步改进，硝酸纤维膜从下往上依次附着有mtbc检测探针、mac检测探针和质控探针，mtbc检测探针和mac检测探针的间距为1cm，mac检测探针和质控探针的间距为2cm。

另外，本发明还提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群和/或鸟-胞内分枝杆菌复合群的试剂盒，试剂盒包括有检测扩增引物对、杂交膜条和杂交显色液，所述杂交显色液包括连接有第二显色标记物的微球，微球富集后显色；

检测扩增引物对至少包括以下一对引物：mtbc扩增引物对的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，mtbc扩增引物对的正向引物5’端还连接有如seqidno.3所示的标签序列，mtbc扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；mac扩增引物对的序列如seqidno.4和seqidno.5所示，mac扩增引物对的正向引物5’端还连接有如seqidno.6所示的标签序列，mac扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；第一显色标记物能与结合有微球的第二显色标记物相连接；

杂交膜条包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上至少附着有以下一种探针：mtbc检测探针的序列如seqidno.10所示，mac检测探针的序列如seqidno.11所示。

检测扩增引物对的正向引物连接的标签序列与对应的探针序列互补配对，即seqidno.3所示的标签序列与seqidno.10所示的mtbc检测探针序列互补配对，seqidno.6所示的标签序列与seqidno.11所示的mac检测探针序列互补配对。

优选地，杂交膜条附着有两种探针：mtbc检测探针和mac检测探针；可用于同时检测结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群。

作为上述技术方案的改进，试剂盒还包质控扩增引物对，所述质控扩增引物对的序列如seqidno.7和seqidno.8所示，质控扩增引物对的正向引物5’端还连接有如seqidno.9所示的标签序列，质控扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；硝酸纤维膜上还附着有质控探针，质控探针的序列如seqidno.12所示。seqidno.9所示的标签序列与seqidno.12所示的质控探针序列互补配对。

优选地，质控扩增引物对的正向引物和反向引物是相对的，若其中一个为正向引物，另一个则是反向引物。

作为上述技术方案的进一步改进，第一显色标记物为生物素，第二显色标记物为链霉亲和素，微球为富集后显示蓝色的乳胶微球。

本发明的有益效果在于：本发明提供检测结核杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的试剂盒，试剂盒包括杂交膜条，杂交膜条和试剂盒是基于单链杂交技术平台而进行开发，具有以下优点：

1)本发明试剂盒通过选取特异的基因片段，实现了单一病原微生物的检测，以及同时检测并区分2种类群病原微生物(结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群)的感染，为筛查提供了一个简单、快速、廉价的选择；

2)优良的检测扩增引物对、探针，结合优化的杂交膜条，使试剂盒具有非常高的特异性和灵敏度；

3)特殊的单链杂交技术，不需要使用杂交仪，在室温情况下即可完成杂交反应；相对于目前普遍使用的杂交方案，节省了时间和设备成本；

4)检测结果可以用肉眼判读，大大降低了使用成本。

附图说明

图1显示本发明试剂盒的检测流程；

图2显示结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的pcr扩增结果；

图3显示杂交膜条上探针的位置；

图4显示实施例1中mtbc样品的检测结果；图中，左侧是第一批样品，右侧是第二批样品；其中，mtbc-p1、mtbc-p2、mtbc-p3、mtbc-p4、mtbc-p5为阳性样品，mtbc-n1为阴性样品；

图5显示实施例2中mtbc样品的检测结果；图中，左侧是第一批样品，右侧是第二批样品；其中，mtbc-n1为阴性样品，mtbc-p1、mtbc-p2、mtbc-p3、mtbc-p4、mtbc-p5为阳性样品；

图6显示实施例3中mac样品的检测结果；图中，左侧是第一批样品，右侧是第二批样品；其中，mac-p1、mac-p2、mac-p3、mac-p4、mac-p5为阳性样品，mac-n1为阴性样品；

图7显示实施例4中参考样品的检测结果；

图8显示实施例5中mtbc样本和mac样本加入干扰物质后的检测结果；其中，图8a的样品是mac阳性样品，图8b的样品是mtbc阳性样品。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实验和附图对本发明作进一步说明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

检测扩增引物、质控扩增引物、探针、标签序列的设计

一种多重pcr技术同时扩增结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的保守序列：通过序列分析，通过大量实验分别选取结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的特异性保守区域作为目标扩增区域，并设计出合适的检测扩增引物和探针，检测扩增引物、质控扩增引物、探针、标签的序列如表1所示。

表1

杂交膜条、试剂盒的制备和检测

本发明所述试剂盒是采用pcr扩增结合膜层析显色的方法同时进行两种病原微生物(结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群)的定性检测。通过一对分别含有核苷酸标签(tag)和生物素标记(biotin)的正反向引物进行pcr扩增。c-pas膜条上固定有与标签序列完全互补的探针，pcr扩增产物可在常温下通过溶液层析作用与膜条上的探针杂交而固定，再通过生物素-链霉亲和素的亲和作用显色，呈现出肉眼可辨析的蓝色条带，试剂盒检测流程如图1所示：

1)在设计好的正向引物的5’端加上特异性的核苷酸标签(mtbc：cgaagttccgagatggcc，mac：gcagattcattggtcagagaaca)，在设计好的反向引物上使用biotin标记(第一显色标记物)；

2)核酸提取：使用广州市宝创生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒(备案号：粤穗械备20150224号)，根据说明书要求操作，进行样本核酸提取：a)临床收集到的样本(如痰液样本)，通过核酸提取试剂盒，提取样本的核酸；b)以提取的核酸作为模板，利用本试剂盒进行pcr扩增和检测，适用于abi等pcr仪器，扩增的体系和程序如下所示：

反应体系为：2×pcr缓冲液10μl(缓冲液是预配试剂，里面包含用于pcr反应的dna聚合酶、镁离子和缓冲液)，mtbc-mac引物5μl，模版dna5μl，混合均匀；同管扩增：95℃，2min；95℃、5s，60℃、10s，35个循环；4℃，保存；

3)凝胶电泳：配置1.5％的琼脂糖凝胶(称取1.5g琼脂糖，加入100ml的tae缓冲液，在微波炉中加热，直至所有琼脂糖全部溶解，待其降温至50～60℃时，按照0.01％的比率加入eb染料，混合均匀后，倒入插有上样梳的制胶板中冷却凝固30min，去除上样梳，将凝胶放入tae缓冲液中准备电泳)，将pcr产物与上样缓冲液混合均匀，上样10μl；在120v的条件下电泳30min，凝胶电泳在紫外光下进行拍照；

4)实验结果如图2所示：采用参考品扩增，pcr反应正常进行，扩增条带明显，没有非特异性扩增产生；

5)杂交膜条制备：将硝酸纤维素膜(4cm×20cm)贴附于pvc(聚氯乙烯)板上(6cm×20cm)，并将吸水纸(2.1cm×20cm)贴在pvc板上，与硝酸纤维素膜有0.1cm重叠；将3条探针，以20ng/μl的浓度喷洒在硝酸纤维素膜上(每一厘米膜上喷洒200ng探针)，每个探针间喷洒红色位置线(红色打印油墨)以区分；硝酸纤维素膜上固定的探针从下往上依次为：针对结核分枝杆菌复合群、鸟-胞内分枝杆菌复合群的探针和质控探针，将制好的pvc板在37℃干燥过夜，并切成杂交膜条(2mm×6cm)备用；硝酸纤维素膜固定的探针的位置如图3所示：质控探针距离位置线1上0.5mm,mac检测探针距离位置线2下0.5mm，mtbc检测探针位置线3上0.5mm，mtbc检测探针和mac检测探针的间距为1cm，mac检测探针和质控探针的间距为2cm；

5)杂交显色液的配置：杂交显色液所含物质的终浓度为：100mmhepps-hcl缓冲液(hepps，4-羟乙基哌嗪丙磺酸)、ph8.0；1m氯化钠，0.4mmedta溶液、ph8.0，1％latex微球，微球上连接有链霉亲和素；

6)将杂交显色液与pcr产物按1：1混合，取出杂交膜条插入相应的pcr管中，静置5～15min后，latex微球在杂交线上富集时，就会显示出其本身蓝色；取出杂交膜条，读取结果，并拍照；如图3所示，位置线3上方出现蓝色条带代表mtbc阳性；位置线2下方靠近位置线2的位置出现蓝色条带代表mac阳性；检测对象为阴性时，只在位置线1上方出现蓝色条带。

实施例1

实验样本：分两批向临床实验单位取总共12个痰液样本，第一批取5个mtbc阳性样本，1个mtbc阴性样本；第二批同样取5个mtbc阳性样本，1个mtbc阴性样本。

检测具体流程如下：

1)核酸提取：痰液样本用1000μl的痰液液化剂充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15min，去除上清，所得沉淀用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取；最后用50μl蒸馏水，洗脱核酸，备用；

2)pcr扩增，反应体系为：2×pcr缓冲液10μl(缓冲液是预配试剂，里面包含了用于pcr反应的dna聚合酶，镁离子和缓冲液)，mtbc-mac引物5μl,模版dna5μl，混合均匀；同管扩增：95℃，2min；95℃、5s，60℃、10s，35个循环；4℃，保存；

3)杂交反应：将杂交显色液与pcr产物按1：1混合，取出杂交膜条插入相应的pcr管中；静置5～15min后，取出杂交膜条读取结果，并拍照。

如图4所示，mtbc对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂盒用于检测结核分枝杆菌复合群的特异性是非常高。

实施例2

实验样本：分两批向临床实验单位取总共8个痰液样本，第一批取1个mtbc阴性样本，3个mtbc阳性样本；第二批同样取1个mtbc阴性样本，3个mtbc阳性样本。

检测具体流程如下：

1)核酸提取：痰液样本用1000μl的痰液液化剂充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15min，去除上清，所得沉淀用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取；最后用50μl蒸馏水，洗脱核酸，备用；

2)pcr扩增，反应体系为：2×pcr缓冲液10μl(缓冲液是预配试剂，里面包含了用于pcr反应的dna聚合酶，镁离子和缓冲液)，mtbc-mac引物5μl,模版dna5μl，混合均匀；同管扩增：95℃，2min；95℃、5s，60℃、10s，35个循环；4℃，保存；

3)杂交反应：将杂交显色液与pcr产物按1：1混合，取出杂交膜条插入相应的pcr管中；静置5～15min后，取出杂交膜条读取结果，并拍照。

如图5所示，mtbc对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂盒用于检测结核分枝杆菌复合群的特异性是非常高。

实施例3

实验样本：分两批向临床实验单位取总共12个痰液样本，第一批取5个mac阳性样本，1个mac阴性样本；第二批同样取5个mac阳性样本，1个mac阴性样本。

检测具体流程如下：

1)核酸提取：痰液样本用1000μl的痰液液化剂充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15min，去除上清，所得沉淀用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取；最后用50μl蒸馏水，洗脱核酸，备用；

2)pcr扩增，反应体系为：2×pcr缓冲液10μl(缓冲液是预配试剂，里面包含了用于pcr反应的dna聚合酶，镁离子和缓冲液)，mtbc-mac引物5μl,模版dna5μl，混合均匀；同管扩增：95℃，2min；95℃、5s，60℃、10s，35个循环；4℃，保存；

3)杂交反应：将杂交显色液与pcr产物按1：1混合，取出杂交膜条插入相应的pcr管中；静置5～15min后，取出杂交膜条读取结果，并拍照。

如图6所示，mac对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂盒用于检测鸟-胞内分枝杆菌复合群的特异性是非常高。

实施例4

企业参考品配置：向国家参考物质中心购买mtbc和mac国家参考品，并使用广州市宝创生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)，按照说明书步骤，进行核酸提取。提取的核酸，使用紫外分光光度仪(nanodrop-2000)进行核酸浓度的测定，再根据测定的浓度，把核酸稀释到浓度为160ng/μl，此时的核酸拷贝数为1.0×10⁵copies/ml，再用蒸馏水稀释到10⁴，10³，10²copies/ml。mtbc和mac的标准菌株购自中国微生物菌种保存中心，使用同样的方法进行核酸提取和浓度标定，分别配置了5个mac(命名为a：10⁵copies/ml，b：10⁴copies/ml，c：10³copies/ml，d：10²copies/ml，e：10⁰copies/ml)和4个mtbc(命名为k：10⁴copies/ml，l：10³copies/ml，m：10²copies/ml，n：10⁰copies/ml)的企业参考品。

具体检测流程如下：

1)核酸提取：痰液样本用1000μl的痰液液化剂充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15min，去除上清，所得沉淀用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取；最后用50μl蒸馏水，洗脱核酸，备用；

2)pcr扩增，反应体系为：2×pcr缓冲液10μl(缓冲液是预配试剂，里面包含了用于pcr反应的dna聚合酶，镁离子和缓冲液)，mtbc-mac引物5μl,模版dna5μl，混合均匀；同管扩增：95℃，2min；95℃、5s，60℃、10s，35个循环；4℃，保存；

3)杂交反应：将杂交显色液与pcr产物按1：1混合，取出杂交膜条插入相应的pcr管中；静置5～15min后，取出杂交膜条读取结果，并拍照。

如图7所示，mtbc-mac的最低检出限均可以达到10³copies/ml，可见本发明试剂盒用于检测结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的灵敏度是非常高。

实施例5

采用的干扰物质：1)口腔清洁液10％加入痰样本，2)醋酸溶液10％加入痰样本，3)含有血液的痰样本，4)使用过抗真菌药物的痰样本，5)试用过抗生素的痰样本，6)1％sds加入dna样本，7)1％乙醇加入dna样本，8)10％nacl加入dna样本；样本包括mtbc样本和mac样本。

以上1～5号样本为临床确认的阳性样本，使用核酸提取试剂进行dna提取后，备用；6-8号样本为无干扰物质的临床阳性样本，提取dna后，再添加对应的物质，制备干扰样本，备用。

检测具体流程如下：

1)核酸提取：痰液样本用1000μl的痰液液化剂充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15min，去除上清，所得沉淀用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取；最后用50μl蒸馏水，洗脱核酸，备用；

2)pcr反应体系和程序为：2×pcr缓冲液10μl(缓冲液是预配试剂，里面包含了用于pcr反应的dna聚合酶，镁离子和缓冲液)，mtbc-mac引物5μl,模版dna5μl，混合均匀；同管扩增：95℃，2min；95℃、5s，60℃、10s，35个循环；4℃，保存；

3)杂交反应：将杂交显色液与pcr产物按1：1混合，取出杂交膜条插入相应的pcr管中；静置5～15min后，取出杂交膜条读取结果，并拍照。

如图8所示，以上所考察的干扰情况，均不影响pcr扩增和膜条杂交反应，检测结果与临床判定结果一致；在检测结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群时，本发明试剂盒具有极强的抗干扰能力。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>广州市宝创生物技术有限公司

<120>检测结核杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的试剂盒

<130>2018.8.13

<160>15

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>1

tcctctgatgccagtcctga20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>2

ggcctccacgaaatccaact20

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>3

cgaagttccgagatggcc18

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>4

tcccgaagagatcaaacgcg20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>5

acgaaatccagctgggtctc20

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>6

gcagattcattggtcagagaaca23

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>7

cagagcacagagacaccact20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>8

ggcgctcatcttcattcagg20

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>9

ttagattcattggtggctagagc23

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>10

ggccatctcggaacttcg18

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>11

tgttctctgaccaatgaatctgc23

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>12

gctctagccaccaatgaatctaa23

<210>13

<211>510

<212>dna

<213>mycobacteriumtuberculosis

<400>13

atggcccaaagggaatgggtcgaaaaagacttctaccaggagctgggcgtctcctctgat60

gccagtcctgaagagatcaaacgtgcctatcggaagttggcgcgcgacctgcatccggac120

gcgaacccgggcaacccggccgccggcgaacggttcaaggcggtttcggaggcgcataac180

gtgctgtcggatccggccaagcgcaaggagtacgacgaaacccgccgcctgttcgccggc240

ggcgggttcggcggccgtcggttcgacagcggctttgggggcgggttcggcggtttcggg300

gtcggtggagacggcgccgagttcaacctcaacgacttgttcgacgccgccagccgaacc360

ggcggtaccaccatcggtgacttgttcggtggcttgttcggacgcggtggcagcgcccgt420

cccagccgcccgcgacgcggcaacgacctggagaccgagaccgagttggatttcgtggag480

gccgccaagggcgtggcgatgccgctgcga510

<210>14

<211>519

<212>dna

<213>mycobacteriumavium

<400>14

atggcccagcgtgaatgggtcgaaaaagacttctacaaggagctgggcgtctcctctgac60

gccagtcccgaagagatcaaacgcgcctaccgcaagctggcgcgcgatctacacccggat120

gccaatcccgacaatcccgctgccggcgaacgattcaaggcggtctccgaggcgcacaac180

gtgttgtcggacccggccaagcgcaaggaatacgacgaaacccgaaggcttttcgccggg240

ggcggtttcggcgggcgccggttcgacaccggtgggttcggcggcttcaacgtcggcggg300

gacggggcggagttcaacctcaacgatttgttcgacgccgccggccgcagcggcggcacc360

aacatcggcgacctgttcggcggcctgttcgggcgggcttcgggcggccggcccagccgg420

ccgcgccgcggcaacgacctcgagaccgagacccagctggatttcgtcgaggccgccaag480

ggcgtggcgatgccgctgcggctgaccagcccggcgccg519

<210>15

<211>153

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>15

cagagcacagagacaccactgacgtgcctgagatgcctcactccaagggccagggagaga60

gcgatcctctggaccatgagcctgccgtgtctccattgctccctcgaaaagagcgaggtc120

ccccggagggcggcctgaatgaagatgagcgcc153