一种与克氏原螯虾体重相关的SNP位点及其特异性引物和应用的制作方法

本发明属于水产养殖基因工程领域，涉及一种与克氏原螯虾体重相关的snp位点及其特异性引物和应用。

背景技术：

克氏原螯虾(procambarusclarkii)俗称小龙虾，是一种杂食性淡水虾类，原产于墨西哥北部和美国南部。近年来，我国克氏原螯虾养殖业发展势头迅猛，现已成为世界最大的小龙虾生产国和消费国。2017年，全国克氏原螯虾养殖面积已超过1200多万亩，产量已达112.97万吨。近年来，克氏原螯虾养殖业已开始由片面追求产量的“大养虾”向以质量效益为中心的“养大虾”转变。克氏原螯虾等甲壳动物的生长过程总是伴随着周期性的蜕皮现象，这种现象是由蜕皮抑制激素(molt-inhibitinghormone，mih)和蜕皮激素相互拮抗来调控的。研究表明，mih基因主要通过抑制y-器官蜕皮激素的合成而对甲壳动物的生长起关键性的调节作用。但mih基因5’-侧翼区与克氏原螯虾体重相关的snp位点尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种与克氏原螯虾体重相关的snp位点及其特异性引物和应用。

本发明的另一目的是提供该snp位点的特异性引物。

本发明的又一目的是提供该snp位点及其引物的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种与克氏原螯虾体重相关的snp位点，所述的位点位于克氏原螯虾mih基因5′-侧翼区-12bp处，碱基变异信息为snpg.-12c>g；该位点gg基因型个体的平均体重显著高于cc基因型个体。

本发明所述的snp位点在选育大规格克氏原螯虾新品系中的应用，其特征在于品种选育时，选择所述的snp位点基因型为gg的个体作为育种亲本。

一种选育大规格克氏原螯虾的方法，通过检测本发明所述的snp位点，选择位点基因型为gg的个体作为育种亲本。

本发明所述的方法优选：提取不同克氏原螯虾个体的基因组dna，采用pcr-rflp技术对不同个体做snpg.-12c>g基因分型，选择所述的snp位点基因型为gg的个体作为育种亲本。

所述的pcr-rflp中使用的pcr上游引物为seqidno.1，下游引物为seqidno.2；使用的限制性内切酶为faei限制性内切酶。

本发明所述的方法进一步优选：提取不同克氏原螯虾个体的基因组dna，pcr扩增含有所述snp位点的基因片段，通过直接测序获得所述snp位点的序列，从而选育大规格克氏原螯虾；其中pcr扩增上游引物为seqidno.1，下游引物为seqidno.2。

用于检测本发明所述的snp位点的pcr引物，上游引物为seqidno.1，下游引物为seqidno.2。

本发明所述的pcr引物在大规格克氏原螯虾品种选育中的应用。

一种筛选大规格克氏原螯虾的试剂盒，包含本发明所述的pcr引物。

有益效果

本研究首次克隆获取了克氏原螯虾mih基因的cdna和dna序列，对位于mih基因调控区(5'-flankingregion与3’-utr区)的单核苷酸多态位点(snps)的分布情况进行了筛查，采用性状-基因型分析策略研究了特定snps与克氏原螯虾体重之间的相关性，发现位于mih基因5’-侧翼区的一个snp位点(snpg.-12c>g)与克氏原螯虾体重性状之间存在着显著的相关性，其中gg基因型个体的平均体重显著高于cc基因型(p<0.001)个体。在以规格(体重)为选育指标的克氏原螯虾遗传育种研究过程中，通过对克氏原螯虾育种群体进行snpg.-12c>g基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为gg的个体作为育种亲本，本研究对于选育大规格克氏原螯虾新品种具有重要的指导意义。

附图说明

图1.克氏原螯虾mih基因结构图

图2.snpg.-12c>g位点的pcr-rflp基因分型电泳图(a)以及测序验证示意图(b)

a图中m表示dl2000marker；1为cc基因型：112bp；2为gg基因型：196bp；3为gc基因型：196bp和112bp；

b图中分别为gg基因型、gc基因型和cc基因型。

具体实施方式

实施例1

(1)克氏原螯虾蜕皮抑制激素(mih)基因组cdna序列的分子克隆

根据genbank中已报道的克氏原螯虾部分序列信息(garh01031176.1)为基础，设计引物扩增mih基因的部分序列(引物序列见表1)。

表1mih基因cdna序列克隆所需引物信息

采用5'/3'kitprotocol-at-a-glance试剂盒对克氏原螯虾眼柄组织总rna进行逆转录，以单链cdna为模板进行race-pcr扩增，对获取的5'-/3'-cdna片段进行拼接，最终获取了mih基因的cdna全长序列。

(2)克氏原螯虾mih基因组dna的分子克隆与生物信息学分析

①克氏原螯虾mih基因内含子序列

以克氏原螯虾mih基因的cdna序列信息为基础，将其氨基酸编码序列进行blast搜索。通过氨基酸序列比对结果，预测克氏原螯虾mih基因的内含子、外显子分布情况。针对每个潜在的外显子序列设计引物，对克氏原螯虾mih基因的所有外显子序列进行扩增和确认。在获得mih基因外显子序列的基础上，设计引物对所预测的2个内含子进行pcr扩增和测序。

表2克氏原螯虾内含子扩增引物信息

对克隆测序所获取的内含子序列进行拼接，获取了克氏原螯虾mih基因的初步结构信息，其dna序列共包含3个外显子和2个内含子。

②5’-侧翼区序列

在初步获取了克氏原螯虾mih基因外显子以及内含子信息的基础上，采用锚定pcr技术克隆获取了mih基因的5′-侧翼区调控序列。

以克氏原螯虾基因组dna为模板，用特异性引物(mih-p1-1r)进行单引物扩增，pcr反应体系为(上海生工)：2×pcrmaster12.5μl，特异性引物mih-p1-1r(5'-aaccatctcttgaagcactactgacac-3'(seqidno.12))1μl(10nm)，dna模板1μl(100ng/μl)，双蒸水补足体积至25μl。pcr反应共计35个循环，94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s；循环结束后于72℃延伸5min。单引物扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，显示无明显条带后纯化备用。

对纯化回收后的单引物扩增产物进行加尾，反应体系为：纯化后的单引物pcr扩增产物17μl，5μl加尾缓冲液(5×tdtbuffer)，1.5μl10mmdctp，1.5μl末端转移酶tdt，37℃保温30min后，70℃保温10min。

以加尾后的单引物扩增产物为模板，利用基因特异性引物和锚定引物(ap：5'-ggccacgcgtcgactagtacgggiigggiigggiig-3'(其中i代表次黄嘌呤核苷)进行pcr扩增。pcr扩增体系为：cloneamphifipcrpremix12.5μl，基因特异性引物mih-p2-1r(5'-cttccacaagcaactcgtagaaccttc-3'(seqidno.13))1μl(10nm)，锚定引物ap1μl(10nm)，加尾产物1μl，双蒸水补足体积至25μl。

pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。pcr产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，泳道呈弥散状，无明显条带。取1000bp-2000bp区域凝胶进行纯化；回收产物连接到peasy-t3zerocloningkit载体，挑选阳性克隆进行测序，最终获取了mih基因1120bp的5′-侧翼调控区序列。进一步的生物信息学分析显示，mih5′-侧翼区内含有潜在的转录起始位点，转录起始位点下游存在无脊椎动物基因调控区普遍存在的tcagc以及tatabox等转录因子结合位点。

对所获取的克氏原螯虾mih基因进行生物信息学分析，最终获得了4205bp的dna序列，序列如seqidno.3所示，包括3个外显子，2个内含子：其中extron1226bp，extron2174bp，extron3836bp；内含子intron11796bp，intron2243bp，以及1120bp的5′-侧翼调控区序列，序列结构信息见图1。

(3)克氏原螯虾mih基因snp筛查及其与体重的相关性分析

①与体重相关的snp位点的初步筛查

采集处于同样培育条件下的克氏原螯虾300只以上(35.41±7.60g)，随机选取100个样品进行基因组dna提取，设计引物对mih基因的5′-侧翼区和3′-utr序列进行pcr扩增。5′-侧翼调控区扩增引物为:mih5f：5′-taaccaagcggctcaatg-3′(seqidno.14)；mih5r：5′-cttccacaagcaactcgtagaaccttc-3′(seqidno.15)；3′-utr区扩增引物为：mih3f：5′-cagacttcaagagatggattgg-3′(seqidno.16)；mih3r：5′-acagatggaaatacgaatgacc-3′(seqidno.17)。

pcr反应体系如下：2×pcrmaster12.5μl，正反向引物各1μl(10nmol/l)，dna模板1μl(100ng/μl)，双蒸水补足体积至25μl。pcr反应共计30个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，66℃/55℃退火30s，72℃延伸60s；循环结束后于72℃延伸5min。

对扩增所得到的pcr产物进行直接双向测序，筛选鉴定mih基因5′-侧翼调控区和3′-utr区的snp位点。针对测序所发现的snp位点，对不同基因型个体的体重进行单因素方差(anova)分析，采用lsd法对总体上表现出显著性差异的不同基因型个体进行两两比较，获取基因型与体重性状之间的相关性。

结果表明：位于mih基因5′-侧翼区-12bp处(即seqidno.3的第918bp处)的snps与克氏原螯虾体重之间存在显著的相关性(p＝0.000)，碱基变异信息为snpg.-12c>g。

表3.克氏原螯虾mih基因snp变异与体重的相关性分析

注：同组中不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

②与体重相关的snp位点的进一步验证

另外选取200个克氏原螯虾样本进行snpg.-12c>g基因分型，进一步验证前期筛查工作的准确性。

采用pcr-rflp技术对200个样本做snpg.-12c>g基因分型，随机挑选不同基因型个体进行pcr产物直接测序，验证pcr-rflp分型结果的准确性。

通过pcr扩增包含有snpg.-12c>g位点的基因片段，扩增长度为196bp。

pcr引物为：crayfish-mihf：5′-gctacctcatactgtatcattc-3′(seqidno.1)；

crayfish-mihr：5′-agcaactcgtagaaccttc-3′(seqidno.2)。

pcr扩增序列信息如下(斜体加黑碱基为引物锚定位点，snps已在序列中标识)：

pcr反应体系为25μl，其中包括2×pcrmaster12.5μl，正反向引物各1μl(10nmol/l)，dna模板1μl(100ng/μl)，双蒸水补足体积至25μl。pcr反应共计30个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s；循环结束后于72℃延伸5min。扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后用于限制性酶切反应。

采用faei限制性内切酶对pcr产物进行酶切，酶切体系包括10×fastdigestgreenbuffer缓冲液1μl，pcr产物5μl，faei0.5u，双蒸水补足体积至10μl。37℃酶切过夜后用2％的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，以确定样本的基因型(图2)。

表4.克氏原螯虾mih基因snpg.-12c>g与体重相关性的基因进一步验证

a：野生型个体数量/杂合型个体数量/突变型个体数量；同组中不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

进一步的样本验证结果表明：位于mih基因5’-侧翼调控区的snpg.-12c>g与克氏原螯虾的体重性状之间存在着显著的相关性，其中gg基因型个体的平均体重显著高于cc基因型个体(p<0.001)。在后续以规格为选育指标的育种工作中，通过对克氏原螯虾育种群体进行snpg.-12c>g基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为gg的个体作为育种亲本，本研究对于后续大规格克氏原螯虾新品种选育研究具有重要的指导意义。

序列表

<110>江苏省淡水水产研究所

<120>一种与克氏原螯虾体重相关的snp位点及其特异性引物和应用

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctacctcatactgtatcattc22

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agcaactcgtagaaccttc19

<210>3

<211>4205

<212>dna

<213>procambarusclarkii

<220>

<221>gene

<222>(918)..(918)

<223>s=g或c

<400>3

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<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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