一种猪病原体的多重PCR检测方法与流程

本发明属于病原体的基因检测技术领域，尤其涉及一种猪病原体的多重pcr检测方法。

背景技术：

猪呼吸道疾病是危害世界养猪业的重要疾病症候群之一，随着养猪业的发展和养殖规模的不断扩大，养殖环境的恶化和养殖规模的不规范，使得猪呼吸道疾病日趋流行，危害日渐严重，给世界养殖业造成巨大的经济损失。目前，猪链球菌(streptococcussuis,ss)、副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis,hps)和猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae,mhp)是引起猪呼吸道疾病的主要病原体，分别引起猪的链球菌病、副猪嗜血杆菌病和支原体肺炎，导致猪呼吸道的急慢性炎症，严重时会引起猪死亡。在猪群中，这些病原菌之间的混合感染十分普遍，不仅提高了猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度，也增加了猪疾病的复杂性和诊断难度。

目前，实验室常用的病原检测方法有病原菌分离、血清学方法、免疫学方法和pcr方法等，其中病原菌分离和pcr方法最常见。但是，病原菌的分离费事费力，不利于采取措施进行及时治疗，敏感性不高，容易出现假阴性结果，而且hps和mhp的体外培养条件苛刻，生长缓慢，容易死亡，容易导致漏检。血清学和免疫学方法因为抗体变化没有规律容易出现假阴性结果。多重pcr是一种利用多条特异性引物在单管pcr反应体系中同时扩增出多个目的核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性和敏感度高等优点，特别适合用于混合感染的大量临床样本的快速诊断。因此，建立ss、hps和mph的多重pcr诊断方法，以达到对这几种疾病进行快速、准确而灵敏的检测和诊断，为这几种病的防治提供科学依据，而且这对提高动物疫病的检测、监控水平和保障动物源性食品安全具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明为解决上述技术问题，提供了一种猪病原体的多重pcr检测方法。由于猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体可同时感染猪，常规的检测方法相对费时、费力，检测成本较高，不利于检测工作的高效开展，基于需要快速、准确诊断混合感染病原的需要，本发明提供一种快速、特异、敏感的猪病原多重pcr检测方法，可同时对猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体3种病原单个或多个混合感染的临床样品进行鉴别诊断，也可用于这3种病原的分子流行病学调查，降低了检测成本，减轻了检测人员的劳动强度。

为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪病原体的多重pcr检测方法，包括以下步骤：

(1)待测样本dna提取：采用dna提取试剂盒提取猪组织待测样本的dna，然后置于-20℃环境下，备用；

(2)pcr反应：将提取得到的猪组织待测样本dna加入反应管中，用涡旋仪将pcr反应管中液体混匀后瞬时离心；

(3)pcr扩增：将上述pcr反应管置于pcr仪中进行扩增；

(4)扩增产物电泳检测：pcr扩增反应终止后，取6μl的pcr扩增产物与溴酚蓝上样缓冲液混合，用移液器依次加入加样孔内，在1％琼脂糖凝胶中进行恒压电泳，电泳完成后，将凝胶取出放入凝胶成像系统中进行拍照；

(5)电泳检测结果分析：将标本孔出现的电泳带与阳性对照和阴性对照进行对比，判定被检样本为副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪肺炎支原体3种病原体阳性或阴性；如果电泳检测出现822bp、689bp、351bp的目的条带，则判定为hps、ss或mhp阳性，说明待测样本中含有副猪嗜血杆菌、猪链球菌或猪肺炎支原体；如果没有目的条带，则判定为阴性。

进一步地，在步骤(1)，dna提取的方法按照dna提取试剂盒说明书进行。

进一步地，在步骤(2)，所述pcr反应的体系为：buffer2.5μl；mg²⁺1.5μl；dntp2μl；ss上下游引物各0.5μl；hps上下游引物各0.5μl；mph上下游引物各0.5μl；taq酶0.25μl；模板2μl；无菌去离子水补足至25μl。

进一步地，所述引物序列为：扩增ss基因的上游引物的序列如seqidno.1所示，下游引物的序列如seqidno.2所示；扩增hps基因的上游引物的序列如seqidno.3所示，下游引物的序列如seqidno.4所示；扩增mph基因的上游引物的序列如seqidno.5所示，下游引物的序列如seqidno.6所示(见表1)。

表1ss、hps、mph基因引物

本发明中，猪链球菌(streptococcussuis,ss)扩增片段(689bp)为：

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副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis,hps)扩增片段(822bp)为：

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猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae,mhp)扩增片段(351bp)为：

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进一步地，所述模板为猪组织待测样本提取得到的dna。

进一步地，在步骤(3)，所述pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。

进一步地，在步骤(4)所述电泳条件为100ma、200v，电泳时间为30min。

所述模板还可以为阳性对照、阴性对照或阴性样本对照，其中，阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，其构建方法是：将扩增产物分别克隆至pmd18-t载体，再转化入感受态细胞，经pcr鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒分别含有相应的目的基因片段；阴性对照为高压灭菌的无菌蒸馏水；阴性样本为胸膜肺炎放线杆菌培养物提取的dna。

随着疾病的感染，猪容易出现继发感染，从而造成更为复杂的病症。这种混合感染的出现，更加大了对于疾病诊断的难度。在疾病的检测方法中，传统的病原的分离方法试验周期长，某些病原的培养条件较为苛刻，具有一定的局限性。血清学检测方法虽然具有较高的特异性，但是很难区分所检测抗体时由注射疫苗产生还是感染病原体所产生。传统单一的pcr检测方法，具有特异性高、检测省事、省力的特点，但难以应对目前同一个机体内多种病原微生物同时感染时进行有效的检测。

本申请针对3种常见的猪呼吸道病原菌ss、hps和mph的相关基因选择特异性引物，建立了三重pcr检测方法。通过退火温度优化试验摸索出56℃为最佳退火温度，在该温度下3种病原体引物均能够得到很好的扩增，同时避免了引物间的非特异性扩增。

将病原体dna进行5倍梯度稀释后进行多重pcr反应，以检测其核酸最低检测量，其最低检测浓度达到pg级，表明该方法有较高的灵敏度。

运用本申请多重pcr检测方法分别对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪丹毒杆菌8种猪病原体进行检测，结果均无特异性扩增，证明本申请方法具有较高的特异性。本申请方法能在短时间完成对待检样品中ss、hps和mph3种病原体单一或混合感染的检测，且操作简便、快捷、结果准确。

由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：

(1)由于猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体可同时感染猪，常规的检测方法相对费时、费力，检测成本较高，不利于检测工作的高效开展，基于需要快速、准确诊断混合感染病原的需要，本发明提供一种快速、特异、敏感的猪病原多重pcr检测方法，可同时对猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体3种病原单个或多个混合感染的临床样品进行鉴别诊断，也可用于这3种病原的分子流行病学调查，降低了检测成本，减轻了检测人员的劳动强度。

(2)本发明利用多重pcr检测具有操作简单、快速、特异性、敏感度高且特别适合用于混合感染的大量临床样本的快速诊断的优点，建立猪病原体ss、hps和mph的快速、特异和灵敏的多重pcr诊断方法，达到对这几种疾病进行快速、准确而灵敏的检测和诊断，为这几种病的防治提供科学依据，而且对提高动物疫病的检测、监控水平和保障动物源性食品安全具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1为副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体的检测图；

图2为应用本发明方法进行副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体3种病原的流行病学调查部分结果。

附图中：图1，其中m为dl2000marker；lane1为阳性对照：含有3种病原目的基因片段的重组质粒；lane2为猪嗜血杆菌阳性；lane3为猪链球菌阳性；lane4为猪肺炎支原体阳性；lane5为胸膜肺炎放线杆菌核酸阴性样本对照；lane6为无菌蒸馏水阴性对照；

图2，其中m为dl2000marker；lane1为阳性对照：含有3种病原目的基因片段的重组质粒；lane2为阴性对照：无菌蒸馏水；lane3、19为猪链球菌阳性；lane4为副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体阳性；lane5、11、15为副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体阳性；lane6、9、10、13、17为阴性；lane7、12为猪链球菌、猪肺炎支原体阳性；lane8、18为副猪嗜血杆菌阳性；lane14为猪肺炎支原体阳性；lane16、20为副猪嗜血杆菌、猪链球菌阳性。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种猪病原体的多重pcr检测方法，包括以下步骤：

(1)待测样本dna提取：采用dna提取试剂盒提取患病猪组织中的副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪肺炎支原体的dna各1ml，dna提取的方法按照dna提取试剂盒说明书进行，然后置于-20℃环境下，备用；

(2)pcr反应：将提取得到的各个猪组织dna加入反应管中，用涡旋仪将pcr反应管中液体混匀后瞬时离心；

所述pcr反应的体系为：buffer2.5μl；mg²⁺1.5μl；dntp2μl；ss上下游引物各0.5μl；hps上下游引物各0.5μl；mph上下游引物各0.5μl；taq酶0.25μl；模板2μl；无菌去离子水补足至25μl；所述引物序列为：扩增ss基因的上游引物的序列如seqidno.1所示，下游引物的序列如seqidno.2所示；扩增hps基因的上游引物的序列如seqidno.3所示，下游引物的序列如seqidno.4所示；扩增mph基因的上游引物的序列如seqidno.5所示，下游引物的序列如seqidno.6所示(见表1)；所述模板为猪组织中提取得到的dna，同时设置阳性对照、阴性对照和阴性样本对照的模板；

(3)pcr扩增：将上述pcr反应管置于pcr仪中进行扩增；所述pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存；

(4)扩增产物电泳检测：pcr扩增反应终止后，取6μl的pcr扩增产物与溴酚蓝上样缓冲液混合，用移液器依次加入加样孔内，在1％琼脂糖凝胶中进行恒压电泳，电泳条件为100ma、200v，电泳时间为30min，电泳完成后，将凝胶取出放入凝胶成像系统中进行拍照；

(5)电泳检测结果分析：将标本孔出现的电泳带与阳性对照和阴性对照进行对比，判定被检样本为副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪肺炎支原体3种病原体阳性或阴性；如果电泳检测出现822bp、689bp、351bp的目的条带，则判定为hps、ss或mhp阳性，说明待测样本中含有副猪嗜血杆菌、猪链球菌或猪肺炎支原体；如果没有目的条带，则判定为阴性。

实验结果参见图1，其中m为dl2000marker，泳道1为阳性对照，泳道2为猪嗜血杆菌阳性，泳道3为猪链球菌阳性，泳道4为猪肺炎支原体阳性，泳道5为阴性样本对照：模板是胸膜肺炎放线杆菌核酸样本，泳道6为阴性对照：模板第无菌蒸馏水。

实施例2

与实施例1不同之处在于：pcr反应的模板还包括含有3种病原目的基因片段的重组质粒、3种病原基因中的一种或一种以上组合、无菌蒸馏水，其他条件不变。

实验结果参见图2，其中m为dl2000marker；泳道lane1为阳性对照：模板含有3种病原目的基因片段的重组质粒；泳道lane2为阴性对照：模板为无菌蒸馏水；泳道lane3、19为猪链球菌阳性；泳道lane4为副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体阳性；泳道lane5、11、15为副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体阳性；泳道lane6、9、10、13、17为阴性；泳道lane7、12为猪链球菌、猪肺炎支原体阳性；泳道lane8、18为副猪嗜血杆菌阳性；泳道lane14为猪肺炎支原体阳性；泳道lane16、20为副猪嗜血杆菌、猪链球菌阳性。

为了进一步说明本申请能够达到所述技术效果，做以下实验：

1、退火温度优化试验

本申请发明人通过退火温度梯度试验，确定副猪嗜血杆菌16srrna基因、猪链球菌gdh基因、猪肺炎支原体ldh基因多重pcr的最佳退火温度。通过创造性地设计pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，52～62℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。将25μl反应体系于52～62℃进行退火温度梯度试验，通过pcr产物电泳确定最佳退火温度。最终结果显示最佳退火温度为56℃。

2、特异性试验

以副猪嗜血杆菌16srrna基因、猪链球菌gdh基因、猪肺炎支原体ldh基因3种目标基因的阳性质粒混合物作为阳性模板对照，分别对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪丹毒杆菌的细菌dna作为模板，运用优化好的多重pcr方法进行检查。结果显示，多重pcr对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体基因组均能扩增出目的条带，且没有其他非特异性反应，对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪丹毒杆菌基因组的扩增结果为阴性，表明与以上几种病原菌之间没有交叉反应。

3、敏感性试验

测定副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体菌株基因组的dna浓度，本申请发明人创造性设计用无菌水将dna浓度调整为50ng/μl，然后分别以无菌水将dna进行5倍梯度稀释为10000pg/μl、2000pg/μl、400pg/μl、80pg/μl、16pg/μl、3.2pg/μl，各菌株每个梯度各取2μl加入pcr反应管中，这样反应体系中同时含有3中基因组dna的量为20000pg、4000pg、800pg、160pg、32pg和6.4pg，通过pcr产物电泳确定最佳退火温度。结果显示多重pcr能同时检测到32pg的基因组dna。

综上所述，由于猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体可同时感染猪，常规的检测方法相对费时、费力，检测成本较高，不利于检测工作的高效开展，基于需要快速、准确诊断混合感染病原的需要，本发明利用多重pcr检测具有操作简单、快速、特异性、敏感度高且特别适合用于混合感染的大量临床样本的快速诊断的优点，建立猪病原体ss、hps和mph的快速、特异和灵敏的多重pcr诊断方法，可同时对猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体3种病原单个或多个混合感染的临床样品进行鉴别诊断，也可用于这3种病原的分子流行病学调查，降低了检测成本，减轻了检测人员的劳动强度，达到对这几种疾病进行快速、准确而灵敏的检测和诊断。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。