口腔中幽门螺杆菌pcr检测方法

口腔中幽门螺杆菌pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法，本发明提供了口腔中Hp的PCR检测方法的构建方法；本发明以幽门螺杆菌铁蛋白基因为检测靶基因建立了口腔中Hp的PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；本发明通过建立口腔中Hp的PCR检测方法，为临床上胃病患者的病因诊断提供了新的依据。本发明所公开的技术方案与传统技术相比，敏感性较高，利用所建立的方法对阳性对照稀释倍数是104～1010的7组不同浓度标准阳性菌液进行检测，本发明通过实验证实，患者胃病由幽门螺杆菌感染引起的，可以通过本方法检测到幽门螺杆菌，并且所建立的PCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好。
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及口腔中幽门螺杆菌的检测方法，具体涉及口腔中幽门螺杆菌PCR检测 方法。 口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法
【背景技术】
[0002] 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的人群在全球范围内约有50%以上， 是引起人类消化性溃疡、慢性胃炎、胃黏膜出现淋巴瘤和胃癌的关键病因。Hp感染相关的病 原菌，在广范围内可以大量的繁殖，生长条件要求低，可以通过不同的途径进行传播，其感 染还具有传染性、致癌性、普遍性和隐蔽性，严重威胁人们的身体健康。在世界范围内，与癌 症有关的致死率中，Hp感染引起的胃癌高居第二。目前，Hp已被世界卫生组织(WHO)列为第 一类致癌因子，因此，加快对Hp感染的研究十分重要和必要。
[0003] Hp的宿主主要是人类，人体胃幽门是Hp特定的定居部位。1983年Warern和 Marhsal 1首次从活动性慢性胃炎患者的胃黏膜中成功培养出Hp，两人因此还在2005年获得 了诺贝尔奖。Hp是目前所知的唯一一种能在人胃中生存的微生物。1989年，Krajedn从口腔 唾液和牙菌斑生物膜中首次成功分离出Hp，从此口腔作为Hp的第二个宿主部位引起人们的 关注。口腔Hp可以伴随口腔中的食物和唾液经消化系统的吞咽过程进入胃内，反之，胃内Hp 可通过反酸与食物返流的方式流入到消化道后进入口腔[4]。后来经证实，口腔Hp和胃内Hp 具有$父尚的同源性。
[0004] 胃中Hp感染和口腔Hp检出确实存在着一定的联系。检测口腔Hp的存在与否也许会 在不同程度的胃炎疾病的鉴定和癌前病变方面有一定的作用。研究发现慢性萎缩性胃炎 (CAG)患者的口腔中Hp的检出率要高于浅表性胃炎和消化性溃疡(PU)患者。因口腔和胃内 Hp有着较高同源性，故唾液和牙菌斑可作为诊断Hp感染类型的可靠的非侵入性检查的标 本。此外，亦可通过对唾液中Hp抗原和抗体的检测给胃部疾病的诊断提供依据。综上所述， 根除口腔Hp可能是防止胃内Hp感染的重要措施，检测口腔Hp的存在与否将会在临床上有着 非常重要的意义。

【发明内容】

[0005] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了 口腔中Hp的PCR检测方法的构建方法;在 此基础上建立了 口腔中Hp的PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；本发明 通过建立口腔中Hp的PCR检测方法，为临床上胃病患者的病因诊断提供了新的依据。
[0006] 本发明的技术方案是：口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法，其特征是：以幽门螺杆菌 铁蛋白基因为检测革巴基因。
[0007] 根据权利要求1所述的幽门螺杆菌的PCR检测方法，其特征在于，具体包括以下步 骤：
[0008] 样品的采集:样品来源于口腔唾液和牙菌斑;早晨空腹未刷牙前，研究对象戴无菌 手套手持无菌EP管，向无菌EP管中收集唾液，及时用封口膜密封管口，以防交叉污染；
[0009]样品的处理:样品收集结束后，立即将样品置于沸水煮沸25min，沸水浴的过程中 勿让沸水进入无菌EP管中；煮沸后，封口膜封口，置于4°C保存备用；
[0010] 普通PCR扩增时的反应体系为25yL，反应体系如下：5yL菌液模板，2.5yL 10XPCR Buffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，浓度均为20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL，0.5yL 的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水；
[0011] 其中，正向引物F为：5' -TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3'
[0012] 反向引物R为：S'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3'。
[0013] 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于:所述的幽门螺杆菌目的基因为 铁蛋白基因，基因片段为SEQ ID No. 1:
[0014] ATGTTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTGAACGAGCAAGTTAACAAGGAGATGCAATCCTCCAACTTGTACATGTC CATGTCCTCCTGGTGTTACACTCACTCCTTGGACGGTGCTGGTTTGTTCTTGTTCGACCACGCTGCTGAGGAGTACG AGCACGCTAAGAAGTTGATCATCTTCTTGAACGAGAACAACGTTCCAGTTCAATTGACTTCCATCTCCGCTCCAGAG CACAAGTTCGAGGGTTTGACTCAAATCTTCCAAAAGGCTTACGAGCACGAGCAACACATCTCCGAGTCCATCAACAA CATCGTTGACCACGCTATCAAGTCCAAGGACCACGCTACTTTCAACTTCTTGCAATGGTACGTTGCTGAGCAACACG AGGAGGAGGTTTTGTTCAAGGACATCTTGGACAAGATCGAGTTGATCGGTAACGAGAACCACGGTTTGTACTTGGCT GACCAATACGTTAAGGGTATCGCTAAGTCCCGTAAGTCCo
[0015] 所述普通PCR扩增时的反应程序为：94°C预变性5min，进行以下循环：94°C变性 30s; 58 °C退火30s; 72 °C延伸40s;分别运行29个循环，72 °C终延伸IOmin。
[0016] 该方法包括以下步骤：（1)样品的采集:样品来源于口腔唾液和牙菌斑；（2)样品的 处理:样品收集结束后，立即将样品置于沸水煮沸25min，煮沸后，封口膜封口，置于4°C保存 备用。其中普通PCR扩增时的反应体系为25yL，反应体系如下:5yL菌液模板，2.5yL 10 X PCR Buffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，浓度均为20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL，0.5yL 的TaqD NA聚合酶，其余为无菌三蒸水。其中，正向引物F为：5' -T TGTC C A AG GACATCATCAAGTTGTTG-3'反向引物R为 j'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3'。
[0017] 所述的口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法，阳性菌液的最适稀释梯度是107,检测幽 门螺杆菌的极限是6 X IO8CFlVmL
[0018] 本发明的积极有益效果：
[0019] 本发明通过设定靶基因为Hp铁蛋白基因，根据靶基因设计合成正向引物、反向引 物，摸索PCR的退火温度、循环次数、模板量，建立了 □腔中Hp的PCR检测方法，为临床上胃病 患者的病因提供新的诊断方法。
[0020] 本发明所公开的技术方案与传统技术相比，敏感性较高，利用所建立的方法对阳 性对照稀释倍数是104~1010的7组不同浓度标准阳性菌液进行检测，结果显示:本发明中 Hp的检测方法对阳性对照稀释倍数是105~109都可以检测到（图1)，检测下限为llCFU/mL; 利用建立的PCR检测方法进行重复性试验，具有较好的重复性;利用不同的细菌和不同动物 的血清进行PCR检测，都未扩增出Hp目的条带（图2)，说明本发明具有较好的特异性;另外本 技术方案还具有样品采集和处理方便、检测通量高、操作简便、成本低以及定量准确等特 点。
[0021 ]本发明通过实验证实，患者胃病由幽门螺杆菌感染引起的，可以通过本方法检测 至Ij幽门螺杆菌，并且所建立的PCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好。
【附图说明】
[0022]图I PCR检测方法灵敏性电泳结果；
[0023]图2 PCR检测方法特异性电泳结果；
[0024] 图3不同退火温度的相同样品PCR电泳结果；
[0025] 图4不同循环次数相同样品PCR电泳结果；
[0026] 图5~13 PCR检测方法对不同样品的PCR检测电泳结果。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图对本发明做详细说明。
[0028] 实施例1.含有外源转入Hp铁蛋白的大肠杆菌菌液的稀释与计数
[0029] 用高压灭菌移液器枪头从含Amp(100yg/mL)的LB固体选择培养基上挑取含有外源 转入Hp铁蛋白的大肠杆菌DH5a单菌落，接种于ImL含Amp (lOOyg/mL)的LB液体选择培养基进 行激活培养，在微需氧条件下37°C、140r/min振荡培养约12h后，取ImL菌液加入9mL的生理 盐水中，进行1~10倍的梯度稀释。稀释后，分别从4~10倍的稀释梯度下(一个稀释梯度做 三个平行，外加一个空白对照)取ImL菌液于相应的无菌平皿中，然后再向平皿中倒入9mL尚 未凝固的含Amp(100yg/mL)的LB固体选择培养基，将其与菌液进行混勾，静置。待其凝固后 置于电热恒温培养箱进行培养18~24h。计数。剩余的不同稀释梯度下的菌液用来进行PCR 扩增后检测，用来确定此检测方法的灵敏度，还可作为本研究最终的阳性模板。
[0030] 结果表明，含有外源插入Hp铁蛋白的大肠杆菌菌液在培养基中的，计数结果见表 1〇
[0031 ]表1阳性对照不同稀释梯度菌液平板计数
[0033]根据平板菌落计数和报告原则，可知在菌液稀释梯度为IO5梯度下Hp菌液量为 1.03 X IO2CFUAiL;在菌液稀释梯度为IO6梯度下Hp菌液量为70CFU/mL;在菌液稀释梯度为 IO7梯度下Hp菌液量为60CFU/mL;在菌液稀释梯度为108、109、10 1()梯度下Hp单菌落量不在30 ~300之间，不统计。
[0034]实施例2样品的收集及处理
[0035] 在2016年1月~2016年3月期间，以新乡学院生命科学技术学院的学生为研究对 象，取人口腔唾液和牙菌斑共50例。
[0036] 口腔唾液收集要求及方法:早晨空腹未刷牙前，让研究对象戴着无菌手套手持无 菌EP管，向无菌EP管中收集唾液，及时用封口膜密封管口，以防交叉污染。
[0037] 口腔牙菌斑收集要求及方法:早晨空腹未刷牙前，戴着无菌手套用无菌牙签在研 究对象磨牙及磨牙邻间隙内刮取牙菌斑，刮取后及时置入含灭菌PBS的无菌EP管中，立即用 封口膜密封管口，以防交叉污染。
[0038]样品收集结束后，立即将样品置于沸水煮沸25min，沸水浴的过程中要小心，勿让 沸水进入到无菌EP管中。防止在煮沸的过程中无菌EP管崩开。煮沸后，封口膜封口，4°C保存 备用。
[0039] 实施例3靶基因的确定及引物设计
[0040] 将幽门螺杆菌铁蛋白基因作为本研究PCR检测方法的靶基因，所述的基因片段的 基因序列为SEQ ID No. 1 ：
[0041] ATGTTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTGAACGAGCAAGTTAACAAGGAGATGCAATCCTCCAACTTGTACATGTC CATGTCCTCCTGGTGTTACACTCACTCCTTGGACGGTGCTGGTTTGTTCTTGTTCGACCACGCTGCTGAGGAGTACG AGCACGCTAAGAAGTTGATCATCTTCTTGAACGAGAACAACGTTCCAGTTCAATTGACTTCCATCTCCGCTCCAGAG CACAAGTTCGAGGGTTTGACTCAAATCTTCCAAAAGGCTTACGAGCACGAGCAACACATCTCCGAGTCCATCAACAA CATCGTTGACCACGCTATCAAGTCCAAGGACCACGCTACTTTCAACTTCTTGCAATGGTACGTTGCTGAGCAACACG AGGAGGAGGTTTTGTTCAAGGACATCTTGGACAAGATCGAGTTGATCGGTAACGAGAACCACGGTTTGTACTTGGCT GACCAATACGTTAAGGGTATCGCTAAGTCCCGTAAGTCCo
[0042]根据所述的基因序列设计引物，正向引物FSW-
[0043] TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3';反向引物R为 j'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-37 〇
[0044] 实施例4PCR检测方法体系组成及反应程序的确定
[0045]所述的PCR扩增时的反应体系为25yL，反应体系如下：5yL菌液模板，2.5yL IOX PCR Buffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，浓度均为20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL， 0.5yL的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水。
[0046] 所述PCR扩增程序为：94°C预变性5min，进行以下循环：94°C变性30s;58°C退火 30s; 72 °C延伸40s;分别运行29个循环，72 °C终延伸IOmin。
[0047]实施例5最适退火温度的摸索
[0048] 取已处理过的样品进行PCR扩增，同时需要阴性对照和阳性对照(含有外源转入HP 铁蛋白的大肠杆菌DH5a菌液模板作阳性对照）^CR反应体系见表2和表3。
[0049]表2阳性菌液和样品PCR反应体系
L 〇〇53j 将上还PCR谷组分分别加人火菌EP営中进仃瞬时离心混习，在PCR扩增仪上执行以 下反应程序:94°C预变性5min，进行以下循环:94°C，30s; 55 °C、56 °C、57°C、58°C，30s; 72°C， 40s;运行29个循环，72°C终延伸lOmin。反应结束后，取PCR产物各5yL，用1.0%琼脂糖凝胶 (含〇.5ygAiL EB)进行电泳检测。最后在紫外线凝胶成像系统上观察结果，确定最适的退火 温度。
[0054]紫外凝胶成像系统结果见图3,结果显示退火温度在58°C时，目的条带最亮，故确 定最适退火温度为58 °C。
[0055]实施例6最适循环次数的确定
[0056] 取已处理过的样品进行PCR扩增，同时需要阴性对照和阳性对照(含有外源转入HP 铁蛋白的大肠杆菌DH5a菌液模板作阳性对照）^CR反应体系见表4和表5。
[0057]表4菌液模板和样品PCR反应体系
[0061 ]将上述PCR各组分分别加入灭菌EP管中进行瞬时离心混匀，在PCR扩增仪上执行以 下反应程序:94°C预变性5min，进行以下循环:94°C，30s;上述确定的最适退火温度，30s; 72 °(：，408;分别运行25、26、27、28、29、30个循环，72°(：终延伸101^11。反应结束后，取?〇?产物各 5yL，用1.0%琼脂糖凝胶(含0.5ygAiL EB)进行电泳检测，确定最适的循环次数。
[0062]结果如图4所示，结果表明循环次数在29个和30个时目的条带都符合要求，相对来 说循环次数越低，PCR扩增效果越好，故确定最合适的循环次数为29次。
[0063]实施例7阳性模板量的确定
[0064]将IO5~101()不同稀释梯度下的菌液进行PCR扩增，同时需要阴性对照和阳性样品 做参比。PCR反应体系见表6和表7。
[0065] 表6菌液和样品PCR反应体系
[0069] 将上述PCR各组分分别加入灭菌EP管中进行瞬时离心混匀，在PCR扩增仪上执行以 下反应程序:94°C预变性5min，进行以下循环:94°C，30s;上述确定的最适退火温度，30s; 72 °C，40s;运行上述确定的最适循环次数，72°C终延伸IOmin。反应结束后，取PCR产物各5yL， 用1.0%琼脂糖凝胶(含〇.5ygAiL EB)进行电泳检测。紫外线凝胶成像系统上观察结果，将 不同稀释梯度下的成像条带和样品成像条带进行对比，以确定最适稀释梯度下的菌液为本 研究的阳性模板，用来做阳性对照。
[0070] 结果如图2所示，结果表明IO7条带与阳性样品含量最为相近，故确定阳性对照菌 液的最适稀释梯度在IO 7。
[0071] 实施例8样品PCR扩增检测
[0072]将已处理过的所有样品进行PCR扩增，需要阴性对照和已确定的阳性模板作为阳 性对照。PCR反应体系见表8和表9。
[0073]表8样品和阳性模板PCR反应体系
[0077]将PCR各组分分别加入灭菌的EP管中进行瞬时离心混匀，在PCR扩增仪上执行以下 反应程序:94°C预变性5min，进行以下循环：94°C，30s ;上述确定的最适退火温度，30s; 72 °C，40s;运行已确定的最适循环次数，72°C终延伸lOmin。反应结束后，取PCR产物各5yL，用 1.0%琼脂糖凝胶(含〇.5ygAiL EB)进行电泳检测。最后在紫外凝胶成像系统上观察实验结 果。
[0078]紫外凝胶成像系统结果如图6~14,在分子量约500bp处出现了特异的核酸条带， 与理论值500bp基本相符，阳性率达到82%。
[0079]实施例9PCR方法灵敏度的检测
[0080] 将IO5~101()的不同稀释梯度下的菌液用来进行PCR扩增后检测，以确定此检测方 法的灵敏度，过程与实施例8相同。
[0081] 结果如图1所示，结果表明此检测方法灵敏度高，可以检测最低限度为llCFU/mL。
[0082] 实施例1OPCR方法特异性的检测
[0083]分别用酵母菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、小鼠血清和人血清进行PCR检测方法特 异性的检测，观察PCR产物中是否有此铁蛋白基因的存在。
[0084]结果如图2所示，结果表明此检测方法特异性强，只能用于检测幽门螺杆菌。
[0085]实施例1lPCR方法重复性的检测
[0086]应用本研究建立的PCR方法，重复5次检测阳性样品，观察5次PCR检测结果是否一 致，据此判断本研究建立的PCR方法的重复性。
[0087]结果表明重复5次检测阳性样品，检测结果一致，结果表明此检测方法重复性好。 [0088]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
【主权项】
1. 口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法，其特征是：以幽门螺杆菌铁蛋白基因为检测靶基 因。2. 根据权利要求1所述的幽门螺杆菌的PCR检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤： 样品的采集:样品来源于口腔唾液和牙菌斑;早晨空腹未刷牙前，研究对象戴无菌手套 手持无菌EP管，向无菌EP管中收集唾液，及时用封口膜密封管口，以防交叉污染； 样品的处理:样品收集结束后，立即将样品置于沸水煮沸25min，沸水浴的过程中勿让 沸水进入无菌EP管中；煮沸后，封口膜封口，置于4°C保存备用； 普通PCR扩增时的反应体系为25yL，反应体系如下：5yL菌液模板，2.5yL 10 X PCRBuffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，浓度均为20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL，0.5 yL的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水； 其中，正向引物F为：5' -TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3' 反向引物R为 A'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3'。3. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于:所述的幽门螺杆菌目的基因为铁 蛋白基因，基因片段为SEQ ID No. 1: ATGTTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTGAACGAGCAAGTTAACAAGGAGATGCAATCCTCCAACTTGTACA TGTCCATGTCCTCCTGGTGTTACACTCACTCCTTGGACGGTGCTGGTTTGTTCTTGTTCGACCACGCTGCTGAGGAG TACGAGCACGCTAAGAAGTTGATCATCTTCTTGAACGAGAACAACGTTCCAGTTCAATTGACTTCCATCTCCGCTCC AGAGCACAAGTTCGAGGGTTTGACTCAAATCTTCCAAAAGGCTTACGAGCACGAGCAACACATCTCCGAGTCCATCA ACAACATCGTTGACCACGCTATCAAGTCCAAGGACCACGCTACTTTCAACTTCTTGCAATGGTACGTTGCTGAGCAA CACGAGGAGGAGGTTTTGTTCAAGGACATCTTGGACAAGATCGAGTTGATCGGTAACGAGAACCACGGTTTGTACTT GGCTGACCAATACGTTAAGGGTATCGCTAAGTCCCGTAAGTCC〇4. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于:所述普通PCR扩增时的反应程序 为:94°C预变性5min，进行以下循环:94°C变性30s;58°C退火30s;72°C延伸40s;分别运行29 个循环，72°C终延伸lOmin。5. 根据权利要求1所述的幽门螺杆菌PCR检测方法，其特征在于:该方法包括以下步骤： (1) 样品的采集:样品来源于口腔唾液和牙菌斑； (2) 样品的处理:样品收集结束后，立即将样品置于沸水煮沸25min，煮沸后，封口膜封 口，置于4 °C保存备用； 其中普通PCR扩增时的反应体系为25yL，反应体系如下：5yL菌液模板，2.5yL 10 X PCR Buffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，浓度均为20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL，0.5yL 的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水； 其中，正向引物F为：5'-TTGTCCAAG GACATCATCAAGTTGTTG-3'; 反向引物R为 A'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3'。6. 根据权利要求4-6任一项所述的口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法，其特征在于：阳性 菌液的最适稀释梯度是1 〇7，检测幽门螺杆菌的极限是6 X 108CFU/mL。
【文档编号】C12Q1/68GK106086213SQ201610650387
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月9日 公开号201610650387.4, CN 106086213 A, CN 106086213A, CN 201610650387, CN-A-106086213, CN106086213 A, CN106086213A, CN201610650387, CN201610650387.4
【发明人】朱艳平, 岳锋, 何勇, 李鹏, 孙国鹏, 张艳芳, 邢瑞林, 徐文慧
【申请人】新乡学院