本发明涉及化学化工领域，且特别涉及一种化合物e1011及其制备方法与应用、马铃薯内生真菌的发酵产物及其乙酸乙酯萃取液。
背景技术：
：马铃薯(solanumtuberosuml.)又称地蛋、土豆、洋山芋等，属茄科多年生草本植物，块茎可供食用，是全球第四大重要的粮食作物，仅次于小麦、稻谷和玉米。中医认为马铃薯“性平味甘无毒，能健脾和胃，益气调中，缓急止痛，通利大便。对脾胃虚弱、消化不良、肠胃不和、脘腹作痛、大便不畅的患者效果显著”。现代研究证明，马铃薯对调解消化不良有特效，是胃病和心脏病患者的良药及优质保健品。并且，马铃薯富有营养，是抗衰老的食物之一。目前国内外学者对马铃薯的化学成分及其应用研究取得了一定进展，但还需要对马铃薯进行深入研究。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种化合物e1011，该化合物e1011的化学结构式为本发明的目的之二在于提供一种化合物e1011的制备方法，该方法简单、易操作，能够有效制备出纯度较高的化合物e1011。本发明的目的之三在于提供一种按上述制备方法得到的马铃薯内生真菌xylariacurta的发酵产物。本发明的目的之四在于提供一种按上述制备方法得到的马铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物的乙酸乙酯萃取液。本发明的目的之五在于提供一种上述化合物e1011、铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物或马铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物的乙酸乙酯萃取液在治疗白血病、肝癌或结肠癌中的应用。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：本发明提出一种化合物e1011，该化合物e1011的化学结构式为：本发明提出一种化合物e1011的制备方法，包括以下步骤：发酵马铃薯内生真菌xylariacurta，用乙酸乙酯对发酵产物进行萃取，对乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱分离；对第四个洗脱组分进行中压制备色谱分离，收集第四个洗脱亚组分进行高压液相制备，收集含量最高的色谱峰组分，干燥。其中，硅胶柱分离的条件包括：以氯仿和甲醇为洗脱液，按浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1以及5:1的比例进行洗脱，得五个洗脱组分。中压制备色谱分离的条件包括：以甲醇和水为洗脱液，按浓度梯度为50:50、60:40：70:30、80:20以及90:10的比例进行洗脱，得五个洗脱亚组分。高压液相制备的条件包括：以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为70:30，最终浓度为85:10进行梯度洗脱40min。本发明还提出了一种上述制备方法得到的马铃薯内生真菌xylariacurta的发酵产物以及该发酵产物的乙酸乙酯萃取液。本发明还提出了一种上述化合物e1011、马铃薯内生真菌xylariacurta的发酵产物或发酵产物的乙酸乙酯萃取液在治疗白血病、肝癌或结肠癌中的应用。本申请提供的化合物e1011及其制备方法与应用、马铃薯内生真菌的发酵产物及其乙酸乙酯萃取液的有益效果包括：本申请提供的化合物e1011的原料均为天然产物，绿色安全，毒副作用小。并且上述化合物e1011为首次从马铃薯内生真菌中分离得到的新物质。其制备方法简单、易操作，能够有效制备出纯度较高的化合物e1011。化合物e1011以及在制备过程中所得到的马铃薯内生真菌xylariacurta的发酵产物和发酵产物的乙酸乙酯萃取液对白血病、肝癌或结肠癌均具有一定的治疗作用。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本申请的化合物e1011及其制备方法与应用、马铃薯内生真菌的发酵产物及其乙酸乙酯萃取液进行具体说明。本申请提供的化合物e1011从马铃薯内生真菌xylariacurta的发酵产物中分离得到，化合物e1011的化学结构式为具体地，马铃薯内生真菌xylariacurta可经以下方式得到：以产地为云南省临沧市，品种为云薯505号的马铃薯为原料，表面消毒，然后将消毒后的马铃薯根、茎、叶小块分别接种于加有青霉素和链霉素混合液的固体培养基上，每板1-2块，依次编号，置于22-25℃恒温培养箱中培养。每日定期观察，当观察到马铃薯各个不同的组织内部向培养基四周长出肉眼可见的菌落时，根据菌落形态、颜色及长出时间，挑取差异明显的单菌落进行纯化培养。上述差异明显的单菌落包括但不仅限于具有以下特征：菌丝为白色，菌落中央为黑褐色，稀疏，成放射状生长。纯化培养的条件如下：挑取菌落前沿白色菌丝至新鲜培养平皿上，重复3次，在普通光学显微镜下观察菌丝的形态，若形态均一，则纯化成功。纯化培养后的马铃薯内生真菌xylariacurta具有但不仅限于以下生理生化特征：生长在pda培养基上菌落中央为黑褐色，周围为白色的放射状菌丝，后期菌产生了色素，使白色的放射状菌丝变为黑褐色。生长在燕麦培养基上菌落菌丝为白色，稀疏，呈放射状，产极少量色素。可参考地，化合物e1011的制备方法包括以下步骤：发酵马铃薯内生真菌xylariacurta，用乙酸乙酯对发酵产物进行萃取，对乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱分离；对第四个洗脱组分进行中压制备色谱分离，收集第四个洗脱亚组分进行高压液相制备，收集含量最高的色谱峰组分，干燥。在本申请中，可先将马铃薯内生真菌xylariacurta接种于15l的种子罐中发酵5-7天，然后再转入100l的发酵罐中发酵培养18-22天。值得说明的是，上述种子罐和发酵罐的容积不限于15l与100l，可根据实际需要进行对应扩大或缩小。作为可选地，马铃薯内生真菌xylariacurta的接种量可以为8-12vt％，例如8vt％、9vt％、10vt％、11vt％或12vt％，也可以为上述各接种量点值之间的任何数值，例如8.5vt％、9.5vt％、10.5vt％或11.5vt％。在一些优选的实施方式中，马铃薯内生真菌xylariacurta的接种量为10vt％。在一些具体的实施方式中，发酵过程中所用的培养基含有4.8-5.2wt％的葡萄糖、0.12-0.18wt％的猪肉蛋白胨、0.45-0.55wt％的酵母粉、0.045-0.055wt％的kh2po4以及0.045-0.055wt％的mgso4。含有上述含量的各营养物质的培养基利于马铃薯内生真菌xylariacurta生长代谢得到目标产物化合物e1011。在本申请的一些实施方式中，发酵可以于24-26℃、ph值为5.9-6.1以及转速为220-280r/min的条件下进行。在一些优选的实施方式中，发酵于25℃、ph值为6.0以及转速为250r/min的条件下进行。发酵过程中可以通气量为0.8-1.2vvm，例如0.8vvm、0.9vvm、1.0vvm、1.1vvm或1.2vvm向发酵体系中通入空气，其中vvm代表通气比，即每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值。值得说明的是，本申请所指的发酵产物为不含菌丝体的发酵液。在萃取发酵产物前，还可先离心过滤含有菌丝体的发酵液，得到菌丝体和滤液(发酵产物)。用有机试剂浸泡菌丝体，得有机试剂浸泡液。浸泡次数可以为1次，也可以为多次，如3次。在一些优选的实施方式中，有机试剂为丙酮，其具有较好的渗透能力，能够使马铃薯内生真菌xylariacurta的细胞膜破裂，将其细胞内未释放到胞外的次生代谢产物尽可能的释放，提高最终化合物e1011的得率。然后混合有机试剂(丙酮)浸泡液和乙酸乙酯萃取液并依次进行硅胶柱分离、中压制备色谱分离和高压液相制备。值得说明的是，在分离前，可将有机试剂(丙酮)浸泡液和乙酸乙酯萃取液浓缩得到浸膏，浸膏与硅胶原料以1:2.5-3.5(优选为1:3)的比例混匀拌样，然后再进行硅胶柱分离。硅胶柱分离以青岛海洋化工有限公司的出售的柱层层析硅胶(200-300目)为原料。硅胶柱分离的条件包括：以氯仿和甲醇为洗脱液，按浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1以及5:1的比例进行洗脱，每个梯度的洗脱体积为3l，得五个洗脱组分，也即组分a、组分b、组分c、组分d和组分e。以上述第四个洗脱组分(组分d)进行中压制备色谱分离，中压制备色谱柱可采用普通的耐高压的反向硅胶柱。中压制备色谱分离的条件包括：以甲醇和水为洗脱液，按浓度梯度为50:50、60:40：70:30、80:20以及90:10的比例进行洗脱，洗脱时间共计60min，得五个洗脱亚组分，也即亚组分a、亚组分b、亚组分c、亚组分d和亚组分e。以上述第四个洗脱亚组分(亚组分d)进行高压液相制备，高压液相制备的条件包括：以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为70:30，最终浓度为85:10进行梯度洗脱40min，收集含量最高的色谱峰组分，干燥即得到化合物e1011。此外，本申请还提供了一种上述化合物e1011、铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物或马铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物的乙酸乙酯萃取液的应用，例如可将其用于治疗白血病、肝癌或结肠癌。可参考地，上述化合物e1011、铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物或马铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物的乙酸乙酯萃取液可用于抑制白血病hl-60或肝癌smmc-7721或结肠癌sw480的生长。实施例1将马铃薯内生真菌xylariacurta以接种量为10vt％接种于15l的种子罐中发酵6天，然后再转入100l的发酵罐中发酵培养20天，得含菌丝体的发酵液。培养基含有5.0wt％的葡萄糖、0.15wt％的猪肉蛋白胨、0.5wt％的酵母粉、0.05wt％的kh2po4以及0.05wt％培养基中。发酵于25℃、ph值为6.0以及转速为250r/min的条件下进行，发酵过程中以通气量为1.0vvm向发酵体系中通入空气。离心过滤上述含菌丝体的发酵液，得到菌丝体和滤液(发酵产物)。用丙酮浸泡菌丝体3次，收集3次所得的丙酮浸泡液。用乙酸乙酯对滤液(发酵产物)萃取3次，收集3次所得的乙酸乙酯萃取液。混合上述丙酮浸泡液和乙酸乙酯萃取液，浓缩得到浸膏。浸膏与硅胶原料以1:3的比例混匀拌样，以氯仿和甲醇为洗脱液，按浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1以及5:1的比例进行硅胶柱分离洗脱，每个梯度的洗脱体积为3l，得到五个洗脱组分：组分a、组分b、组分c、组分d和组分e。收集上述组分d，以甲醇和水为洗脱液，按浓度梯度为50:50、60:40：70:30、80:20以及90:10的比例进行中压制备色谱分离洗脱，洗脱时间共计60min，得到五个洗脱亚组分：亚组分a、亚组分b、亚组分c、亚组分d和亚组分e。收集上述亚组分d，以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为70:30，最终浓度为85:10进行梯度洗脱40min，收集含量最高的色谱峰组分，干燥，得到化合物e1011。实施例2将马铃薯内生真菌xylariacurta以接种量为8vt％接种于15l的种子罐中发酵5天，然后再转入100l的发酵罐中发酵培养18天，得含菌丝体的发酵液。培养基含有4.8wt％的葡萄糖、0.12wt％的猪肉蛋白胨、0.45wt％的酵母粉、0.045wt％的kh2po4以及0.045wt％培养基中。发酵于24℃、ph值为5.9以及转速为220r/min的条件下进行，发酵过程中以通气量为0.8vvm向发酵体系中通入空气。离心过滤上述含菌丝体的发酵液，得到菌丝体和滤液(发酵产物)。用丙酮浸泡菌丝体3次，收集3次所得的丙酮浸泡液。用乙酸乙酯对滤液(发酵产物)萃取3次，收集3次所得的乙酸乙酯萃取液。混合上述丙酮浸泡液和乙酸乙酯萃取液，浓缩得到浸膏。浸膏与硅胶原料以1:2.5的比例混匀拌样，以氯仿和甲醇为洗脱液，按浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1以及5:1的比例进行硅胶柱分离洗脱，每个梯度的洗脱体积为3l，得到五个洗脱组分：组分a、组分b、组分c、组分d和组分e。收集上述组分d，以甲醇和水为洗脱液，按浓度梯度为50:50、60:40：70:30、80:20以及90:10的比例进行中压制备色谱分离洗脱，洗脱时间共计60min，得到五个洗脱亚组分：亚组分a、亚组分b、亚组分c、亚组分d和亚组分e。收集上述亚组分d，以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为70:30，最终浓度为85:10进行梯度洗脱40min，收集含量最高的色谱峰组分，干燥，得到化合物e1011。实施例3将马铃薯内生真菌xylariacurta以接种量为12vt％接种于15l的种子罐中发酵7天，然后再转入100l的发酵罐中发酵培养22天，得含菌丝体的发酵液。培养基含有5.2wt％的葡萄糖、0.18wt％的猪肉蛋白胨、0.55wt％的酵母粉、0.055wt％的kh2po4以及0.055wt％培养基中。发酵于26℃、ph值为6.1以及转速为280r/min的条件下进行，发酵过程中以通气量为1.2vvm向发酵体系中通入空气。离心过滤上述含菌丝体的发酵液，得到菌丝体和滤液(发酵产物)。用丙酮浸泡菌丝体3次，收集3次所得的丙酮浸泡液。用乙酸乙酯对滤液(发酵产物)萃取3次，收集3次所得的乙酸乙酯萃取液。混合上述丙酮浸泡液和乙酸乙酯萃取液，浓缩得到浸膏。浸膏与硅胶原料以1:3.5的比例混匀拌样，以氯仿和甲醇为洗脱液，按浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1以及5:1的比例进行硅胶柱分离洗脱，每个梯度的洗脱体积为3l，得到五个洗脱组分：组分a、组分b、组分c、组分d和组分e。收集上述组分d，以甲醇和水为洗脱液，按浓度梯度为50:50、60:40：70:30、80:20以及90:10的比例进行中压制备色谱分离洗脱，洗脱时间共计60min，得到五个洗脱亚组分：亚组分a、亚组分b、亚组分c、亚组分d和亚组分e。收集上述亚组分d，以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为70:30，最终浓度为85:10进行梯度洗脱40min，收集含量最高的色谱峰组分，干燥，得到化合物e1011。实施例4将马铃薯内生真菌xylariacurta以接种量为10.5vt％接种于15l的种子罐中发酵6.5天，然后再转入100l的发酵罐中发酵培养21天，得含菌丝体的发酵液。培养基含有5.1wt％的葡萄糖、0.16wt％的猪肉蛋白胨、0.52wt％的酵母粉、0.052wt％的kh2po4以及0.052wt％培养基中。发酵于25.5℃、ph值为6.0以及转速为260r/min的条件下进行，发酵过程中以通气量为1.1vvm向发酵体系中通入空气。离心过滤上述含菌丝体的发酵液，得到菌丝体和滤液(发酵产物)。用丙酮浸泡菌丝体1次，收集所得的丙酮浸泡液。用乙酸乙酯对滤液(发酵产物)萃取1次，收集所得的乙酸乙酯萃取液。混合上述丙酮浸泡液和乙酸乙酯萃取液，浓缩得到浸膏。浸膏与硅胶原料以1:3的比例混匀拌样，以氯仿和甲醇为洗脱液，按浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1以及5:1的比例进行硅胶柱分离洗脱，每个梯度的洗脱体积为3l，得到五个洗脱组分：组分a、组分b、组分c、组分d和组分e。收集上述组分d，以甲醇和水为洗脱液，按浓度梯度为50:50、60:40：70:30、80:20以及90:10的比例进行中压制备色谱分离洗脱，洗脱时间共计60min，得到五个洗脱亚组分：亚组分a、亚组分b、亚组分c、亚组分d和亚组分e。收集上述亚组分d，以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为70:30，最终浓度为85:10进行梯度洗脱40min，收集含量最高的色谱峰组分，干燥，得到化合物e1011。实施例5将马铃薯内生真菌xylariacurta以接种量为9.5vt％接种于15l的种子罐中发酵5.5天，然后再转入100l的发酵罐中发酵培养19天，得含菌丝体的发酵液。培养基含有4.9wt％的葡萄糖、0.14wt％的猪肉蛋白胨、0.48wt％的酵母粉、0.048wt％的kh2po4以及0.048wt％培养基中。发酵于24.5℃、ph值为6.0以及转速为240r/min的条件下进行，发酵过程中以通气量为0.9vvm向发酵体系中通入空气。用乙酸乙酯对滤液(发酵产物)萃取3次，收集3次所得的乙酸乙酯萃取液，浓缩得到浸膏。浸膏与硅胶原料以1:3的比例混匀拌样，以氯仿和甲醇为洗脱液，按浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1以及5:1的比例进行硅胶柱分离洗脱，每个梯度的洗脱体积为3l，得到五个洗脱组分：组分a、组分b、组分c、组分d和组分e。收集上述组分d，以甲醇和水为洗脱液，按浓度梯度为50:50、60:40：70:30、80:20以及90:10的比例进行中压制备色谱分离洗脱，洗脱时间共计60min，得到五个洗脱亚组分：亚组分a、亚组分b、亚组分c、亚组分d和亚组分e。收集上述亚组分d，以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为70:30，最终浓度为85:10进行梯度洗脱40min，收集含量最高的色谱峰组分，干燥，得到化合物e1011。试验例1重复实施实施例1-5，得到足够多的化合物e1011。对所得的化合物e1011进行结构测定，包括核磁共振测定、高分辨质谱(hresims)测定、紫外测定以及红外测定。核磁共振测试结果如表1所示：表1化合物e1011的1hnmr(600mhz)和13cnmr(150mhz)数据(cdcl3，δinppm，jinhz)位置δhδc1-164.925.84,dd,16.0,1.7121.736.75,dd,16.0,4.6147.545.53,m72.152.05,m,1.75,m27.161.75,m,1.54,m26.975.16,m69.781.19,d,6.517.89-164.8105.98,dd,15.8,0.75126.1116.55,dd,15.8,7.8141.8125.12,m76.8135.16,m69.6141.37,d,5.717.84-oac-170.22.0721.112-oac-170.02.10,21.1高分辨质谱测定结果为：化合物e1011的分子量为m/z[m+k]+(计算值：c18h24o8，368.14)。紫外(uv)测定结果为：化合物e1011的主要紫外数据(meoh)：225nm(3.1)。红外(ir)测定结果为：化合物e1011的主要红外数据：1635.44，600.12。此外，上述化合物e1011为无色油状物，比旋光度为[α]22d＝14(c0.05，ch3oh)。cd数据(ch3oh)：200nm(-17.0)，217nm(+31.4)。通过上述测定，得出本方案中所得的化合物e1011的化学结构式为表1中各位置分别对应于试验例2采用如下试验方法，对实施例所得的化合物e1011进行细胞活性抑制试验。待测细胞包括白血病hl-60、肺癌a-549、肝癌smmc-7721、乳腺癌mcf-7以及结肠癌sw480。(一)、化合物e1011的浓度为40μm1.接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(dmem或者rmpi1640)配成单个细胞悬液，以每孔3000-15000个同种细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，细胞提前12-24小时接种培养。2.加入化合物e1011溶液：化合物e1011用dmso溶解，化合物e1011以40μm浓度初筛，每孔终体积200μl，每种细胞处理均设3个复孔。3.显色：37℃培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加mts溶液20μl和培养液100μl；悬浮细胞弃100μl培养上清液，每孔加20μl的mts溶液；设3个空白复孔(mts溶液20μl和培养液100μl的混合液)，继续孵育2-4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。4.比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(multiskanfc)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后得到细胞平均抑制率。5.阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(ddp)和紫杉醇(taxol)两个阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(reedandmuench法)计算化合物的ic50值。其结果如表2和表3所示。表2细胞抑制率表3ic50值(二)、设置化合物e1011梯度浓度为40μm、8μm、1.6μm、0.32μm以及0.064μm1.接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(dmem或者rmpi1640)配成单个细胞悬液，以每孔3000-15000个同种细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，细胞提前12-24小时接种培养。2.加入化合物e1011溶液：化合物e1011用dmso溶解，化合物e1011以40μm、8μm、1.6μm、0.32μm以及0.064μm浓度复筛，每孔终体积200μl，每种细胞处理均设3个复孔。3.显色：37℃培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加mts溶液20μl和培养液100μl；悬浮细胞弃100μl培养上清液，每孔加20μl的mts溶液；设3个空白复孔(mts溶液20μl和培养液100μl的混合液)，继续孵育2-4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。4.比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(multiskanfc)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后计算化合物e1011的ic50值。其结果如表4所示。表4ic50值对比表3以及表4可以看出，化合物e1011对上述五种细胞中的白血病hl-60、肝癌smmc-7721以及结肠癌sw480具有明显的抑制作用，且其中对肝癌smmc-7721以及结肠癌sw480细胞的ic50值明显低于阳性对照顺铂。说明本申请得到的化合物e1011能够用于抑制白血病hl-60、肝癌smmc-7721以及结肠癌sw480的生长，尤其能够对肝癌smmc-7721和结肠癌sw480起到较佳的抑制效果。换而言之，化合物e1011可用于治疗白血病、肝癌或结肠癌，含有上述化合物e1011的铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物以及马铃薯内生真菌xylariacurta发酵产物的乙酸乙酯萃取液也可用于治疗白血病、肝癌或结肠癌。综上所述，本申请提供的化合物e1011的原料均为天然产物，绿色安全，毒副作用小。并且上述化合物e1011为首次从马铃薯内生真菌中分离得到的新物质。其制备方法简单、易操作，能够有效制备出纯度较高的化合物e1011。化合物e1011以及在制备过程中所得到的马铃薯内生真菌xylariacurta的发酵产物和发酵产物的乙酸乙酯萃取液对白血病、肝癌或结肠癌均具有一定的治疗作用。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12