一种针对RSV粘附G蛋白表面抗原的全人源单克隆抗体的制作方法

本发明涉及全人源抗体，特别是全人源的抗呼吸道合胞病毒(rsv)g表面糖蛋白的单克隆抗体。

背景技术：

呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,rsv)是引起婴幼儿、青少年急性下呼吸道感染的主要病原，也是引起小儿毛细支气管炎、流行性喘憋性肺炎的主要病毒性抗原，同时rsv感染也会在老年人、患有慢性肺部疾病的成年个体以及免疫功能低下的成人(例如骨髓移植病人)身上爆发。据世界卫生组织估计全球6400万呼吸道疾病中有16-100万死亡病例是由rsv感染导致。

rsv疫苗的研制已有40多年的历史，历经灭活/重组疫苗、抗病毒复合物、反义药物、rna干扰技术、抗体药物(例如免疫球蛋白、静脉注射单克隆抗体)等阶段。在中国据最新研究报道，复旦大学王宾教授领导的团队发明了新型免疫耐受疫苗技术，采用抗原加免疫调节剂的方法，该方法克服了常规rsv疫苗引发肺部病理性炎症反应以及中和抗体效价低的不足。国际上，分离自供体的静脉注射免疫球蛋白(rsv-igiv；)和一种单克隆抗体palivizumab(synagis^tm)，已经获得批准用于高危儿童rsv的预防，尚无获批用于成人的预防药物。目前也没有一种商业化的治疗rsv的疫苗，只有利巴韦林被批准用于rsv感染的治疗。为了有效的预防和治疗rsv感染，在应用rsv-igiv和palivizumab时，鉴于二者的低特异性，往往需要高剂量、频繁注射，而且还需要考虑供体的可用性。因此，需要寻找其他的预防和治疗rsv感染的药剂。

众所周知，rsv有两个主要的表面糖蛋白，融合蛋白f和粘附蛋白g。成熟型g负责将病毒颗粒结合到靶细胞上；f蛋白则介导病毒被膜与细胞融合和合胞体形成。根据rsvg蛋白末端碱基的不同，rsv可以分为a和b两个亚型。在过去的十年里，rsv诱导的病理学机制研究越来越关注于rsv的g蛋白上，并且支持该糖蛋白治疗靶点的呼声不断涌现。一些关于rsv感染动物模型的病理学研究关乎g蛋白介导的减少适当的抗病毒细胞反应的免疫反应失调，并且已经鉴定出rsvg蛋白含有一个特殊的重要的cx3c趋化因子模序。抗体能够与之结合，有效的阻断该模序的功能，降低病毒复制和减缓动物罹病程度。尽管抗g蛋白抗体的预防功效已经在小鼠、棉鼠中初步建立，但是近期的感染后治疗模型也显示在减缓rsv发病和增强病毒清除能力上抗g抗体优于抗f抗体。

rsv代表了一个主要的公共卫生问题，尤其是影响6个月以下的儿童。现场及时诊断这种高传染性病毒加上早期干预治疗可以基本上减少与呼吸道合胞病毒感染有关的急性和长期病态。一种特别有前途的靶点就是rsvg蛋白。在啮齿动物模型，针对rsvg蛋白的抗体在降低病毒载量和改善病毒引起的免疫功能低下两方面均已经取得显著效果。由于rsv感染啮齿类动物的时间进程毕竟与人类不同，抗g单克隆抗体疗法的效用评估等待临床试验。为了达到这个目的，结合rsvg蛋白关键的蛋白基的高亲和性人源抗体已有报道。临床数据显示可能会在未来2-3年内用于这一类感染疾病的治疗。目前上市的抗rsv单克隆抗体只批准用于预防早产儿感染rsv，是抗f蛋白的抗体，抗g蛋白抗体仍处于研发阶段。本发明涉及全人源抗体，特别是全人源的抗呼吸道合胞病毒(rsv)g表面糖蛋白的单克隆抗体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供具有较高亲和力的抗rsvg蛋白的全人源单克隆抗体。

根据本发明的一个方面，提供全人源抗rsvg蛋白单克隆抗体rsvg71或rsvg78。单克隆抗体rsvg71的重链、轻链(kappa)的核酸序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示，其相应的重链、轻链(kappa)的氨基酸序列分别如seqidno:3和seqidno:4所示。单克隆抗体rsvg78的重链、轻链(kappa)的核酸序列分别如seqidno:5和seqidno:6所示，其相应的重链、轻链(kappa)的氨基酸序列分别如seqidno:7和seqidno:8所示。

所述rsvg71或rsvg78抗体序列可以是全长dna序列，也可以是其片段，所述片段包括fab、fab'、f(ab')2、单链fv(scfv)、fv、dsfv等，优选的，所述抗体是全人源的。

本发明还涉及所述抗rsvg全人源抗体的衍生物，包括通过对上述rsvg71或rsvg78抗体的重链和/或轻链氨基酸序列的插入、取代和/或缺失形成的并具有相同功能的抗体，涉及含有上述rsvg71或rsvg78的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体-因子融合蛋白、抗体-化学偶联物等，也应涉及全人源抗体的片段，所述片段为fab、fab'、f(ab')2、单链fv(scfv)、fv、dsfv、双抗体、fd和fd'片段。本发明还涉及上述rsvg71或rsvg78抗体的抗原结合片段，特别是选自上述片段的抗原结合片段。

根据本发明的第二个方面，提供编码本发明的抗rsvg单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列。在优选的实施方案中，所述核酸序列包含seqidno:1和/或seqidno:2的序列。在另一个优选的实施方案中，所述核酸序列包含seqidno:5和/或seqidno:6的序列。

根据本发明的第三个方面，提供制备全人源抗rsvg蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)提供表达载体，所述表达载体含有编码本发明的全人源抗rsvg蛋白单克隆抗体的dna分子，含有表达rsvg蛋白的dna序列，以及与所述dna分子可操作相连的表达调控序列；

(2)用所述表达载体转化宿主细胞；

(3)在适合所述全人源抗rsvg单克隆抗体表达的条件下培养所述宿主细胞；

(4)分离纯化获得所述的全人源抗rsvg蛋白单克隆抗体。

所述表达载体指本领域熟知的细菌质粒，优选的是重组表达载体，选自pcdna3.1-zeo(+)或者phlx101中的一种或者多种的组合。

所述宿主细胞可以是293t细胞系、293f细胞系、中国仓鼠卵巢(cho)细胞系、ns0、sp2/0细胞系、hela细胞系、幼仓鼠肾(bhk)细胞系、猴肾细胞(cos)系、人肝癌细胞系、549a细胞系、3t3细胞系、以及转化的b-细胞中的一种或多种组合。

根据本发明的第五方面，提供本发明的全人源抗rsvg蛋白单克隆抗体、核酸、载体或宿主细胞在制备用于预防或治疗rsv相关疾病的治疗剂中的应用。

根据本发明的第六方面，提供用于治疗rsv相关疾病的药物组合物，药物组合物中包含治疗有效量的本发明的单克隆抗体、核酸、载体或宿主细胞，和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂是本领域技术人员熟知的，包括生理相容的水性和非水性载体、稳定剂、防腐剂、增溶剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、缓冲液、血清蛋白等。

所述rsv相关疾病选自由病毒性肺炎、间质性肺炎、毛细支气管炎组成的组。

根据本发明的第七方面，涉及本发明的全人源抗rsvg蛋白单克隆抗体、核酸、载体或宿主细胞在制备用于检测rsv的检测试剂中的应用。

本发明提供的抗rsvg蛋白单克隆抗体是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)的抗rsv抗体相比，因物种差异导致的免疫原性大大减少，且特异性好、亲和力高，如果用于临床将大大降低副作用，而且抗g抗体在降低病毒载量和改善病毒引起的免疫功能低下较抗f抗体更具有优势。此外，由于本发明中的单克隆抗体可以和rsvg抗原特异性结合，在rsv的诊断和检测中也有很好的应用。应用于人时不会产生类似鼠抗体所产生的副作用。

附图说明

图1是rsvg71和rsvg78蛋白纯化后的电泳图；

图2是rsvg抗原纯化后的电泳图；

图3是elisa实验检测单克隆抗体rsvg71和rsvg78与g抗原的结合力。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1全人源抗rsv抗体rsvg71和rsvg78的制备

1、人工合成rsvg71和rsvg78的重链和轻链

按照序列如seqidno:1所示的单克隆抗体rsvg71的重链、序列如seqidno:2所示的单克隆抗体rsvg71的轻链(kappa)的核酸序列；如seqidno:3所示的单克隆抗体rsvg78的重链、如seqidno:4所示的单克隆抗体rsvg78轻链(kappa)的核酸序列，送genewiz公司人工合成。

将人工合成得到的rsvg71和rsvg78重链、轻链作为模板，分别加入taq酶和dntps，以及引物，进行pcr，得到pcr产物。

2、重组抗体的表达载体的构建

利用快速dna产物纯化试剂盒(购自康为世纪)回收pcr产物，得到40μlpcr产物待用。

分别对rsvg71和rsvg78的重链、轻链目的片段进行双酶切，双酶切体系为：nheⅰ/notⅰ各0.5μl、10*fastdigestgreenreactionbuffer3μl以及pcr产物26μl，37℃恒温5h。

对载体进行双酶切，双酶切体系为：nheⅰ/notⅰ各0.5μl、10*fastdigestgreenreactionbuffer3μl、载体为pcdna3.1-zeo(+)(invitrogen公司)1μg、用h2o补齐30μl，37℃恒温30min。然后加入2μl碱性磷酸酶和3.5μl10*buffer(neb)混匀，37℃恒温水浴2h。

上述目的片段和载体的双酶切体系中所使用的nheⅰ、notⅰ、10*fastdigestgreenreactionbuffer均购自thermoscientific。

对将酶切后的rsvg71和rsvg78的重量、轻链目的片段分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并通过紫外仪观察结果。用小刀将目的条带切下放入一个称量好重量的ep管中，利用快速琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(购自康为世纪)回收各个目的片段。

将各个目的片段分别和载体进行连接，连接体系为：载体2μl、目的片段15μl、t4dnaligase(购自neb)1μl、缓冲液2μl，混匀后16℃恒温水浴保持2h。

将每个目的片段的所有连接产物加入到e.colidh5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s后，迅速置于冰浴5min。然后加入800μl培养基，37℃振荡(100r/min)温育1h。将培养菌液10000rpm离心15s，去除800ul上清，重悬沉淀，全部涂布于含氨苄青霉素钠(100μg/ml)的lb固体培养基上,正向放入37℃培养箱中培养1h，再倒置培养过夜至菌落清晰。挑取单菌落接种到5ml含氨苄青霉素钠(100μg/ml)的lb液体培养基中，37℃振荡培养15h。利用高纯度质粒小提试剂盒(购自康为世纪)提取质粒，获得分别含有rsvg71的重链(rh71)、rsvg71的轻链(rk71)、rsvg78的重链(rh78)、rsvg78的轻链(rk78)的质粒，并送样测序。

测序结果显示单克隆抗体rsvg71的重链、轻链(kappa)的核酸序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示，其相应的重链、轻链(kappa)的氨基酸序列分别如seqidno:3和seqidno:4所示；单克隆抗体rsvg78的重链、轻链(kappa)的核酸序列分别如seqidno:5和seqidno:6所示，其相应的重链、轻链(kappa)的氨基酸序列分别如seqidno:7和seqidno:8所示。

实施例2单克隆抗体rsvg71和rsvg78的表达和纯化

用实施例1中获得的含有rsvg71的重链(rh71)的质粒和含有rsvg71的轻链(rk71)的质粒，以及用含有rsvg78的重链(rh78)的质粒和含有rsvg78的轻链(rk78)的质粒分别转染293t细胞。先用opti-mem(1x)buffer分别稀释质粒和pei，然后将pei-opti-mem混合物缓慢加入到质粒-opti-mem混合物管中，室温静置20分钟后，再将pei和质粒混合物加入到细胞悬液中。转染时细胞浓度为0.25～0.5×10⁶个细胞/ml，每孔细胞的转染使用2.5μg含有rsvg71重链的质粒+2.5μg含有rsvg71轻链的质粒+10μgpei，以及2.5μg含有rsvg78重链的质粒+2.5μg含有rsvg78轻链的质粒+10μgpei。转染结束后在37℃培养48h后收获上清，用elisa检测上清。

使用rproteinasepharosefastflow(ge)纯化表达的抗体蛋白。分别收集表达rsvg71和rsvg78的293t细胞培养物上清，10000rpm，4℃离心10min，取上清，将该上清加入到已用平衡缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液，150mm氯化钠，ph7.4)平衡好的rproteinasepharosefastflow柱上，用同样的平衡缓冲液洗10个床体积，再用洗脱缓冲液(0.1mgly-hcl缓冲液，ph2.5)流洗5个床体积，收集前3个床体积，向收集的洗脱液中加入1/10提及的中和液(1mtris-hcl缓冲液，ph9.0)混匀，加入到amiconultra-15centrifugalfilters(merckmillipore)中，5000g、4℃离心20min，浓缩蛋白，再向amiconultra-15centrifugalfilters中加入上述平衡缓冲液，5000g、4℃离心20min，更换新的平衡缓冲液，重复3次，分别获得浓缩后的rsvg71和rsvg78抗体蛋白，将其分别转到1.5ml离心管中，取样测定蛋白质含量，然后置于4℃保存。

分别取纯化的rsvg71抗体和纯化的rsvg78抗体进行电泳，结果如附图1所示，其中泳道m是标准蛋白；泳道rsvg71是纯化的rsvg71抗体，有两个明显条带，分别是约50kda的重链和约22kda的轻链；泳道rsvg78是纯化的rsvg78抗体，有两个明显条带，分别是约50kda的重链和约22kda的轻链。

实施例3rsvg抗原的表达纯化

(1)g蛋白表达载体的构建

首先通过基因工程手段人工合成g蛋白目标序列，在其序列的n端增加6个his，可以与镍柱中的镍结合，从而可以通过亲和层析进行纯化，并在两端增加nheⅰ/notⅰ两个酶切位点。将合成的g蛋白dna片段和表达载体pcdna3.1-zeo(+)(invitrogen公司)均通过nheⅰ/notⅰ进行双酶切，回收g蛋白目的片段和表达载体片段，进行连接，转化，通过pcr和酶切方法鉴定阳性克隆，最后通过测序验证表达载体的正确性。采用碱裂解法大量提取质粒用于瞬时转染。

(2)瞬时转染293f细胞

获得的重组质粒pcdna3.1-zeo(+)-g转染293f细胞。先用opti-mem(1x)buffer分别稀释质粒和pei，然后将pei-opti-mem混合物缓慢加入到质粒-opti-mem混合物管中，室温静置20分钟后，再将pei和质粒混合物加入到细胞悬液中。转染时细胞浓度为0.25～0.5×10⁶个细胞/ml，每孔细胞的转染使用5μg重组质粒pcdna3.1-zeo(+)-g+10μgpei。转染结束后在37℃，5％co2的培养箱中培养96h后收获上清。

(3)g蛋白的纯化

收集大规模培养的293f细胞上清，离心后采用镍柱进行纯化，镍柱中的镍离子能够与his标签结合，也能够与咪唑进行结合。首先将样品按一定流速流过镍柱，使得样品中的g蛋白与镍柱结合，然后加入不同浓度的咪唑，与g蛋白竞争结合镍柱，从而将g蛋白洗脱下来。取3mlni-nta填装层析柱，用缓冲液1(20mmtris-hclph8.0，0.5mnacl)平衡6～8个床体积，流速为2ml/min；将细胞上清12000rpm离心10min，取上清上样，流速为1ml/min；用缓冲液1再洗5个床体积，流速为2ml/min；分别用含10mm、300mm咪唑的洗脱缓冲液进行阶段洗脱10个床体积，流速为2ml/min，g蛋白的主要洗脱峰出现在300mm咪唑的洗脱条件。经纯化获得的g蛋白其分子量约为60kda，如附图2，与理论分子量一致。

实施例4rsvg71和rsvg78抗体与抗原g蛋白的elisa检测

所用试剂包括：

pbs(1x)：用pbs(10x)和去离子水配置。

pbst：pbs(1x)加tween-20至终浓度为0.05％。

封闭液：pbs(1x)+2％bsa+2％新生牛血清，现用现配。

稀释液：pbst+1％bsa，稀释抗体用。

终止液：将6ml95％-98％的浓硫酸慢慢加入180ml水中，冷却后备用。

一抗：本发明制备得到的rsvg71和rsvg78抗体，稀释成工作浓度为100μg/ml。

二抗：peroxidase-conjugatedaffinipuregoatanti-humanigg(h+l)(购自jacksonimmunoresearch)，取1.5ml的无rnase水完全溶解后，备用。

用pbs(1x)(ph7.4)缓冲液稀释g蛋白作为抗原，使包被抗原溶液的终浓度为2ng/μl，吸取100μl包被抗原溶液加入到96孔板的每孔中，2-8℃包被过夜，用pbst清洗5次，然后每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h，封闭结束后用pbst清洗5次，每次停留1分钟。

用抗体稀释液(pbst+1％bsa)将一抗做5倍稀释：即取7个高压灭菌的1.5ml离心管，每一管加入240μl的抗体稀释液，从工作溶液中取60μl一抗溶液，涡旋震荡混匀后，标记为1:5稀释，从1:5稀释的溶液中取60μl放入下一管中，以此类推，分别为：1:5，1:25，1:125，1:625，1:3125，1:15625，1:78125，分别加到相应的孔中，每孔100μl，做两个平行，并设立两个空白孔用pbst代替一抗，37℃孵育90min，然后用pbst清洗5遍。

用抗体稀释液(pbst+1％bsa)将二抗做4000倍稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h，然后用pbst清洗5遍，加入tmb显色液，100μl/孔，室温孵育15min，孵育结束后加入h2so4终止液终止反应。在酶标仪上读取od450nm读数。

将得到的数值以柱形图的形式表示，如附图3。结果显示，rsvg71和rsvg78抗体与g抗原的结合是特异性的，并且与阴性对照相比，在初始浓度100ng/ul下差异显著。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

序列表

<110>苏州博泰神州生物技术有限公司

<120>一种针对rsv粘附g蛋白表面抗原的全人源单克隆抗体

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