一种图书馆用的绿色无污染抗菌肽及其制备与应用的制作方法

本发明涉及生物技术及抗菌技术领域，具体涉及来源于淡水小龙虾(procambarusclarkii)的抗菌肽及其制备方法与应用。

背景技术：

图书馆是每一所高校必备的功能单位，主要为广大师生提供纸质与电子期刊的借阅服务。因此，它也是各类书刊使用的密集空间。在图书馆这样的公共场所里，具有两个明显的特点，第一，借阅人员的流动性很大，这样给图书馆的环境卫生保持方面造成一定的压力；第二，纸质书籍的借阅对象具有不确定性，其所处环境不可把控，因此，在书籍借阅的流通环节，书籍自身的卫生安全具有一定的隐患。此外，加上图书馆是一个相对密闭的空间，空气的流动性较差，人员往来十分繁杂，这些因素叠加起来之后，会给图书馆的环境卫生造成一定的影响。尤其，对于各类常见的病原菌的控制，应该是图书馆环境卫生治理的重点。图书馆具有一个洁净的环境，细菌、真菌等病原控制在安全范围之内，一方面，对于借阅书籍、期刊的借阅者和在馆内阅读书籍、期刊的读者的身体健康有利，另一方面，洁净的图书馆环境对于书籍的收藏、保护工作也是一个重要保证。

现在对于图书借阅、存储过程中滋生的细菌、真菌在图书馆的书架、地面、角落等处繁殖之后，大多时候采取的是紫外线照射杀菌，这种方式有两个弊端，第一，存在除菌时间的限制，必须闭馆使用紫外线；第二，紫外线杀菌的时候会产生臭氧，污染馆内空气，对于人体健康存在安全风险。因此，开发一种既对环境没有污染，又可以高效除菌的新型图书馆用的除菌剂，将会有良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供来源于淡水小龙虾(procambarusclarkii)的新的抗菌肽。本发明的另一目的在于提供所述抗菌肽的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述抗菌肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

来源于淡水小龙虾(procambarusclarkii)的新的抗菌肽，分别命名为pc-crustin4与pc-crustin5蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.1与seqidno.2所示，分别为127个和167个氨基酸残基。

进一步地，淡水小龙虾体内，所述抗菌肽pc-crustin4与pc-crustin5蛋白质基因的开放阅读框对应的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示，分别长384bp与504bp。

上述抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)以提取的淡水小龙虾总rna作为模板，进行反转录pcr得到cdna。

(2)以步骤(1)获得的cdna作为模板，进行pcr扩增获得含上述抗菌肽编码序列(开放阅读框序列)的核苷酸片段。

(3)步骤(2)的扩增产物与原核表达载体通过酶切、连接、转化，构建可表达重组抗菌肽的大肠杆菌工程菌。

(4)步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌通过诱导培养，表达出重组抗菌肽。

进一步地，所述抗菌肽为pc-crustin4时，反转录引物为：5’-cccggtggaccgctagacgg-3’；pcr扩增引物为：f1：5′-nncactatggcttctacggt-3′，r1：5′-nnctagacgggggccttgca-3′。

进一步地，所述抗菌肽为pc-crustin5时，反转录引物为：5’-caaagatcgggcacgatcaacaact-3’；pcr扩增引物为：f2：5′-nncatggctactacagtcac-3′，r2：5′-nnctagacggtggctttgca-3′。

pcr扩增引物中，nn由保护碱基和限制性内切酶酶切位点组成，n表示任意碱基，n为自然数，可根据表达载体进行相应的调整。

本发明对抗菌肽pc-crustin4、pc-crustin5以及两者混合物与常见病原菌进行了液体抑菌实验，针对图书馆一般藏书室书架表面的杂菌的除菌实验，针对图书馆一般阅览室读书书桌表面的杂菌的除菌实验，针对图书馆特殊的老、旧书籍特藏室的空气中杂菌的除菌实验，结果显示本发明的抗菌肽pc-crustin4、pc-crustin5以及两者混合物(尤其是两者混合物)具有良好的抑菌、除菌活性。因此，抗菌肽pc-crustin4和/或pc-crustin5可用于制备抑菌剂或除菌剂。

一种抑菌剂或除菌剂，包含抗菌肽pc-crustin4和/或pc-crustin5。进一步的，所述抑菌剂或除菌剂包含pc-crustin4和pc-crustin5时，两者质量比为1:1。所述抑菌剂或除菌剂在图书馆防霉、除菌中的应用。

本发明的优点和有益效果：本发明的pc-crustin4和/或pc-crustin5具有良好的抑制细菌、抑制真菌的活性，在图书馆珍贵古老图书收藏过程的防霉除菌方面，图书馆室内物体表面的除菌方面以及图书馆室内空气的除菌方面有着良好的应用前景。

附图说明

图1是重组淡水小龙虾抗菌肽rpc-crustin4的诱导表达与亲和纯化结果图。泳道1是诱导前大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道2是iptg诱导后的大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道3是纯化后的rpc-crustin4重组蛋白质，泳道m是标准的蛋白质分子量。

图2是重组淡水小龙虾抗菌肽rpc-crustin5的诱导表达与亲和纯化结果图。泳道1是诱导前大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道2是iptg诱导后的大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道3是纯化后的rpc-crustin5重组蛋白质，泳道m是标准的蛋白质分子量。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1两种淡水小龙虾重组抗菌肽rpc-crustin4与rpc-crustin5蛋白质的制备

(1)利用动物总rna提取试剂盒提取淡水小龙虾肝胰腺、鳃、肠3种等质量组织的混合组织样品的总rna，获得淡水小龙虾混合组织的总rna样品。

(2)以步骤(1)获得的淡水小龙虾总rna样品作为模板，以特异引物5’-cccggtggaccgctagacgg-3’(pc-crustin4)和5’-caaagatcgggcacgatcaacaact-3’(pc-crustin5)分别作为反转录合成反应的后引物，利用一步法rt-pcr扩增试剂盒分别进行cdna的反转录合成，获得淡水小龙虾混合组织样品的两种cdna样品。

(3)分别设计扩增淡水小龙虾两种抗菌肽基因pc-crustin4和pc-crustin5编码区表达片段(成熟肽)的前后引物pc-crustin4f/r和pc-crustin5f/r：

pc-crustin4-f：5′-gccgaattccactatggcttctacggt-3′，

pc-crustin4-r：5′-gccctcgagctagacgggggccttgca-3′；

pc-crustin5-f：5′-gccgaattccatggctactacagtcac-3′，

pc-crustin5-r：5′-gccctcgagctagacggtggctttgca-3′。

分别以步骤(2)中的淡水小龙虾混合组织的cdna样品作为模板，进行梯度pcr扩增反应，针对pc-crustin4扩增反应的程序为：98℃预变性3min，第一扩增梯度：95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸30s，循环15圈；第二扩增梯度：95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，循环15圈；第三扩增梯度：95℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，循环15圈；后延伸5min。针对pc-crustin5扩增反应的程序为：98℃预变性3min，第一扩增梯度：95℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸60s，循环15圈；第二扩增梯度：98℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸60s，循环15圈；第三扩增梯度：98℃变性30s，61℃退火45s，72℃延伸60s，循环15圈；后延伸10min。分别获得pcr扩增反应产物。

(4)分别将步骤(3)获得的pcr扩增反应产物进行回收以及纯化，之后分别进行ecorⅰ核酸内切酶和xhoⅰ核酸内切酶的双酶切处理，并且分别与经过ecorⅰ核酸内切酶和xhoⅰ核酸内切酶双酶切处理的大肠杆菌pet-28-a质粒载体连接，分别转化大肠杆菌bl21(de3)表达菌株感受态细胞之后，分别利用pc-crustin4f/r和pc-crustin5f/r两对引物进行菌落pcr反应筛选目的基因的阳性表达菌株，分别将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行两个目的基因的序列验证。

(5)将步骤(4)获得的目的基因阳性表达菌株进行iptg浓度梯度复合温度梯度式的诱导表达，方法如下：分别将淡水小龙虾两种抗菌肽基因(pc-crustin4和pc-crustin5)阳性表达菌株接入到装有200ml液体lb培养基的1000ml三角瓶中，在37℃、180rpm条件下，摇床避光转培养3h，之后，加入终浓度为0.1mm的iptg，在28℃、180rpm条件下继续摇床避光培养12h，之后，调整iptg终浓度为0.3mm，28℃、180rpm条件下摇床避光继续培养12h，之后，调整iptg终浓度为0.5mm，28℃、180rpm条件下摇床避光继续培养12h，之后，6000rpm条件下离心收集菌体。

(6)将步骤(5)获得的两种菌体分别进行不同低温复合超声波的方式进行菌体破碎，首先对菌体进行-20℃条件下的冷冻处理60min，之后在-40℃条件下的冷冻处理60min，之后，利用超声波破碎仪进行细菌菌体破碎60min，然后，再次对菌体进行-40℃条件下的冷冻处理60min，再次对菌体进行-20℃条件下的冷冻处理60min，之后，分别在10000rpm条件下离心收集破碎后的沉淀。

(7)将步骤(6)获得的破碎后的两种沉淀，分别利用20ml变性液(0.15mtris-hcl，5mmdtt，6m脲，ph7.0)，在37℃、180rpm条件下摇床避光震荡2h，之后，分别在12000rpm条件下离心收集上清液，并且，利用截留能力为3.5kda的透析袋分别进行过夜12h、4℃低温透析处理，透析液配方为0.15mtris-hcl，10mmcysteins，ph7.0。

(8)将步骤(7)透析完毕的两种液体，分别进行10000rpm条件下的离心处理，并且收集上清液，即为两种目的重组蛋白质的变性-复性液，并且，利用预装5ml的his-tag凝胶柱进行纯化，首先，用10ml1×pbs缓冲液冲洗his-tag凝胶柱3次，之后，将获得的两种目的重组蛋白质的变性-复性液10ml缓慢流通his-tag凝胶柱3次，再用15ml洗脱液(500mm咪唑，20mmtris-hcl，ph7.0)洗脱柱子，并且收集洗脱液，利用截留能力为3.5kda的透析袋在1×pbs缓冲液中进行4℃低温12h透析处理，次日，利用聚乙二醇12000进行浓缩处理，分别使两种目的重组蛋白rpc-crustin4与rpc-crustin5的终浓度为200μg·ml^-1。

两种重组淡水小龙虾抗菌肽rpc-crustin4与rpc-crustin5的诱导表达与亲和纯化结果见图1与图2。图1显示，与诱导前大肠杆菌菌体总蛋白相比较，iptg诱导之后，重组蛋白质有明显的表达量；而且，亲和纯化之后获得了组分单一、浓度较高的目的rpc-crustin4重组蛋白质，泳道3的蛋白质条带的位置接近标准蛋白质分子量的17kda条带，与理论预期的16.9kda相一致，说明表达正确。图2显示，与诱导前大肠杆菌菌体总蛋白相比较，iptg诱导之后，重组蛋白质有明显的表达量；而且，亲和纯化之后获得了组分单一、浓度较高的目的rpc-crustin5重组蛋白质，泳道3的蛋白质条带的位置位于标准蛋白质分子量的17kda与25kda条带之间，与理论预期的21.3kda相一致，说明表达正确。

(9)将(8)制备的重组抗菌肽rpc-crustin4与rpc-crustin5蛋白质按照等比例(质量体积浓度)混合后，按照1:100体积比用蒸馏水稀释之后即为抗菌肽复合剂；同时，重组抗菌肽rpc-crustin4与rpc-crustin5分别用蒸馏水按照1:100体积比稀释，用于后续实验。

实施例2抗菌肽与常见病原菌的液体抑菌实验

将实施例1获得的重组抗菌肽rpc-crustin4、rpc-crustin5和抗菌肽复合剂与常见病原菌进行液体抑菌实验，首先选择金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、白色念珠菌、毕赤酵母作为病原菌进行常规过夜培养，次日，将利用1×pbs缓冲液进行2倍梯度稀释的100μl的不同抗菌肽溶液分别与100μl目标病原菌菌液混合后，置于清洁的一次性96孔酶标板的点样孔之中进行孵育，同时，牛血清白蛋白(bsa)作为对照组，并且，每一个点样孔中再加入100μl液体贫瘠(pb)培养基(1％胰蛋白胨，质量体积比为0.5％的nacl，ph为7.0)。之后，28℃条件下，静置培养24h；期间，利用分光光度计600nm波长测定各个细菌混合液中病原菌的生长情况，确定不同抗菌肽对各种病原菌的最小抑菌浓度。

实验结果显示：重组抗菌肽rpc-crustin4、rpc-crustin5和抗菌肽复合剂均可以有效地抑制金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶藻弧菌、白色念珠菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的生长繁殖，对于副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、肺炎克雷伯氏菌、毕赤酵母的生长繁殖也有一定程度的抑制作用(表1)，而且，重组抗菌肽rpc-crustin4与rpc-crustin5蛋白质混合使用，对于微生物的抑制作用，可以发挥协同作用，针对多数选择的病原菌，混合起来使用两种抗菌肽的作用要比单一使用一种抗菌肽的抑菌作用要优。

表1抗菌肽对不同病原菌的最小抑菌浓度以及对比分析

实施例3抗菌肽对图书馆一般藏书室书架表面的杂菌的除菌实验

将实施例1获得的重组抗菌肽rpc-crustin4、rpc-crustin5和抗菌肽复合剂针对图书馆一般藏书室书架表面的杂菌的除菌实验。首先，利用高温灭菌处理的棉球蘸取少量无菌水，擦拭图书馆一般藏书室书架的10cm²表面，置于50ml灭菌处理的离心管中，再加入5ml灭菌水进行充分润洗，即为杂菌原液。之后，取制备的杂菌原液100μl置于1.5ml灭菌处理的离心管中，加入100μl实施例1制备的用蒸馏水按照1:100体积比稀释的抗菌肽，之后，在超净工作台中将上述混合液在固体lb培养基上进行涂板处理，之后，置于37℃培养箱中进行恒温培养12h。次日，对固体lb培养基上的杂菌菌落进行计数。同时，以100μl灭菌水、100μl高温灭菌处理的1×pbs缓冲液作为对照组。此外，每组实验重复三次，进行方差分析。

实验结果显示：与加入100μl灭菌水、100μl高温灭菌处理的1×pbs缓冲液的两个对照组相比较，加入100μl抗菌肽可以明显的降低从图书馆收集来的杂菌制备的杂菌原液中的杂菌个数，说明本发明抗菌肽具有较强的除菌作用(表2)。而且，数据显示：重组抗菌肽rpc-crustin4与rpc-crustin5蛋白质混合使用，对于微生物的抑制作用，可以发挥协同作用，混合起来使用两种抗菌肽的作用要比单一使用一种抗菌肽的除菌作用要优。

表2抗菌肽对图书馆一般藏书室书架表面的杂菌的除菌实验结果以及对比分析

注：表中**表示与加入灭菌水的处理组相比较，差异极显著。

实施例4抗菌肽对图书馆一般阅览室读书书桌表面的杂菌的除菌实验

将实施例1获得的重组抗菌肽rpc-crustin4、rpc-crustin5和抗菌肽复合剂针对图书馆一般阅览室读书书桌表面的杂菌的除菌实验。首先，利用高温灭菌处理的棉球蘸取少量无菌水，擦拭图书馆一般阅览室看书书桌的10cm²表面，置于50ml灭菌处理的离心管中，再加入5ml灭菌水进行充分润洗，即为杂菌原液。之后，取制备的杂菌原液100μl置于1.5ml的灭菌处理的离心管中，加入100μl实施例1制备的用蒸馏水按照1:100体积比稀释的抗菌肽，之后，在超净工作台中将上述混合液在固体lb培养基上进行涂板处理，之后，置于37℃培养箱中进行恒温培养12h。次日，对固体lb培养基上的杂菌菌落进行计数。同时，以100μl灭菌水、100μl高温灭菌处理的1×pbs缓冲液作为对照组。此外，每组实验重复三次，进行方差分析。

实验结果显示：与加入100μl灭菌水、100μl高温灭菌处理的1×pbs缓冲液的两个对照组相比较，加入100μl抗菌肽可以明显的降低从图书馆一般阅览室读书书桌表面收集来的杂菌制备的原液中的杂菌个数，说明本发明抗菌肽具有较强的除杂菌作用(表3)。而且，数据显示：重组抗菌肽rpc-crustin4与rpc-crustin5蛋白质混合使用，对于微生物的抑制作用，可以发挥协同作用，混合起来使用两种抗菌肽的作用要比单一使用一种抗菌肽的除菌作用要优。

表3抗菌肽对图书馆一般阅览室读书书桌表面的杂菌的除菌实验结果以及对比分析

注：表中**表示与加入灭菌水的处理组相比较，差异极显著。

实施例5抗菌肽对图书馆特殊的老、旧书籍特藏室的空气中杂菌的除菌实验

将实施例1获得的重组抗菌肽rpc-crustin4、rpc-crustin5和抗菌肽复合剂针对图书馆特殊的老、旧书籍特藏室的空气中杂菌的除菌实验。首先，将直径为15cm的、灭菌处理的玻璃培养皿置于图书馆特殊的老、旧书籍特藏室的书架之上，培养皿与培养皿的盖子均打开放置24小时，并且开口向上，收集空气中的杂菌。之后，利用10ml灭菌水对培养皿与培养皿的盖子进行充分润洗，转移到新的50ml灭菌处理的离心管中，即为杂菌原液。之后，取制备的杂菌原液100μl置于1.5ml的灭菌处理的离心管中，加入100μl实施例1制备的用蒸馏水按照1:100体积比稀释的抗菌肽，之后，在超净工作台中将上述混合液在固体lb培养基上进行涂板处理，之后，置于37℃培养箱中进行恒温培养12h。次日，对固体lb培养基上的杂菌菌落进行计数。同时，以100μl灭菌水、100μl高温灭菌处理的1×pbs缓冲液作为对照组。此外，每组实验重复三次，进行方差分析。

实验结果显示：与加入100μl灭菌水、100μl高温灭菌处理的1×pbs缓冲液的两个对照组相比较，加入100μl抗菌肽可以明显的降低从图书馆特殊的老、旧书籍特藏室的空气中收集来的杂菌制备的杂菌原液中的杂菌个数，说明本发明抗菌肽具有较强的除杂菌作用(表4)。而且，数据显示：重组抗菌肽rpc-crustin4与rpc-crustin5蛋白质混合使用，对于微生物的抑制作用，可以发挥协同作用，混合起来使用两种抗菌肽的作用要比单一使用一种抗菌肽的除菌作用要优。

表4抗菌肽对图书馆特殊的老、旧书籍特藏室的空气中杂菌的除菌实验结果以及对比分析

注：表中**表示与加入灭菌水的处理组相比较，差异极显著；*表示与加入灭菌水的处理组相比较，差异显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>内蒙古科技大学

<120>一种图书馆用的绿色无污染抗菌肽及其制备与应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>127

<212>prt

<213>procambarusclarkii

<400>1

metservalmetasntyrglnhisleualaleuvalleuthrleugly

151015

valleuleuserthrgluvalalaglyhistyrglyphetyrglyhis

202530

glnglyglntyrargpropheglyhispheglyglyglyglyglyarg

354045

pheglnglyglyargglypheproglyasnthrpheglyglyglyarg

505560

ileproglyglyglyglyglyglythrthrvalasnargprovalgly

65707580

glythrcysproprovalargprosercysthralaserargsergln

859095

proalathrcysthrseraspargglncysserglyglyphelyscys

100105110

cyspheaspalacysvalglnthrgluvalcyslysalaproval

115120125

<210>2

<211>167

<212>prt

<213>procambarusclarkii

<400>2

metcysalathrmetasncysvalleuleualavalvalleuserleu

151015

glyleuleuleuglythraspalahisglytyrtyrserhisargarg

202530

sertyrargprotyrglytyrpheglyglyglyglyserilepheasn

354045

aspaspilepheglyglyglyargglyproglyserilephearggly

505560

asnargpheglnglyglyglyglyleuproglyglypheglnglygly

65707580

glyglypheproglyglyasnglypheproglyglyasnileglygly

859095

glyglyalathrglythrasnglyalaserglyasnthrglyserasn

100105110

alaileilethrproglyglyglyglysercysproproalaargleu

115120125

alacysproserthrargserglnprovalglncysthrseraspser

130135140

glucysleualaglyarglyscyscyspheaspalacysvalglnthr

145150155160

gluvalcyslysalathrval

165

<210>3

<211>384

<212>dna

<213>procambarusclarkii

<400>3

atgtctgtgatgaattatcaacatctcgccctcgtcttgaccctgggtgtcctcctgagc60

acggaggtggctggacactatggcttctacggtcaccaaggccagtaccgaccattcggt120

cactttggaggaggaggaggcagattccaaggaggtcgtggctttcctgggaataccttc180

ggaggcggaagaatcccaggtggtggtggtggtggtaccacagttaacaggcccgtagga240

gggacctgtcccccagtgcgaccttcctgcacagcctccaggtcccagccggctacgtgt300

acgtcggacagacagtgttcagggggcttcaagtgctgcttcgacgcctgtgtccagacc360

gaagtgtgcaaggcccccgtctag384

<210>4

<211>504

<212>dna

<213>procambarusclarkii

<400>4

atgtgtgcgacgatgaactgtgtgcttctggccgtggtcttgtccctgggtctcctcctg60

ggcactgacgcccatggctactacagtcaccgtcgttcataccggccctacggttacttt120

gggggaggtggctctatattcaatgacgacattttcggaggtggcagaggaccgggaagt180

atcttcagaggcaacagattccaaggtggcggtgggttgcctggtggattccaagggggc240

ggtggattcccaggaggcaatggattccctggaggaaacatcggaggcggcggtgccaca300

ggaaccaacggagcgagcgggaacaccggatctaatgctattatcacacctggaggagga360

gggagctgccccccagcacgcttagcctgcccgtctacgagatcgcagccagtccagtgc420

acgtcggacagcgagtgtctggcgggccgcaagtgctgctttgatgcctgcgttcagacc480

gaagtgtgcaaagccaccgtctag504

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cccggtggaccgctagacgg20

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

caaagatcgggcacgatcaacaact25

<210>7

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gccgaattccactatggcttctacggt27

<210>8

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gccctcgagctagacgggggccttgca27

<210>9

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gccgaattccatggctactacagtcac27

<210>10

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gccctcgagctagacggtggctttgca27