本发明属于微生物技术领域，涉及一种分离内生真菌的专用培养基，具体涉及一种分离与培养内生木霉真菌的专用培养基。本发明还给出了这种专用培养基的制备方法及其在分离与培养内生木霉真菌上的应用。
背景技术：
木霉属(trichodermapers.)真菌在世界范围内分布广泛，其既是土壤微生物的重要群落之一，也是一种植物内生真菌，从土壤、植物根际、茎部、叶片、种子及球茎表面、枯枝落叶腐木等植物残体以及其它真菌的子实体上等均可分离到。现有研究资料表明，木霉菌在农业、工业、环境保护等方面有着广泛的应用价值，其在农业领域的应用表现尤为突出，现已有多种木霉菌生防制剂、生物菌肥、诱抗剂、种子包衣剂等产品获得登记和商业化生产并在农业生产中发挥了重要作用。
相对于土壤木霉菌，内生木霉菌的研究起步较晚，相关的报道较少，但由于内生木霉菌可与寄主植物共生，在抗病、抗逆性等方面优势明显，其自身的抗病、抗逆性较强等许多优势，目前越来越得到研究者的重视，开发和应用潜力巨大。专利cn106520570a公开了一种枇杷内生钩状木霉菌株cctccno：m2016366，该菌株具有抑菌广谱性，对5种植物病原菌都表现出抑菌活性，其对稻瘟菌的抑制效果最强，可用于植物病害防治。专利cn106399128a给出一种植物根际盐碱土中木霉菌的快速分离方法，主要通过植物根际盐碱土壤采集和取样方法、采集后土壤处理和土壤稀释液的制备、分离培养基的筛选和改良、分离菌株活化、培养和鉴定等技术的改进，研发获得植物根际盐碱土中木霉菌快速分离技术。专利cn105154339a提供了一种绿色木霉菌菌株tvir-6，绿色木霉菌tvir-6菌株为从土壤中分离到的真菌，对作物安全无害，且对根结线虫具有防治作用，在应用中具有安全性，适用于根结线虫的生物防治。
在已公开的相关资料中，主要涉及土壤木霉菌的分离鉴定与内生木霉菌的应用等研究。对于内生木霉菌的分离，近年来大多仍利用内生真菌的分离方法，即采用组织分离法，或是使用pda培养基+适量链霉素制成平板进行分离。但是，现有内生真菌的分离方法易使木霉菌丝分散，分离频率低，杂菌较多，不易计数和挑单菌落，分离种类较少，专一性也差。
技术实现要素：
本发明针对现有分离内生木霉菌培养基的上述缺陷或不足，提供一种分离与培养内生木霉真菌的专用培养基。这种专用培养基是一种分离内生木霉菌效果较优的选择性培养基，能够高效、快速和准确地分离出内生木霉菌，对木霉菌抑制率低而对其他杂菌抑制效果好，可形成较单一的和菌落特征较好的木霉菌，分离种类较多，易于识别与纯化，专一性强。
为实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
本发明给出一种分离内生木霉真菌的专用培养基，其组分包括马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯和灭菌水；所述马铃薯、葡萄糖、琼脂粉和水制备成pda培养基；在每升(1000ml)pda培养基中，氯霉素的含量为50～150mg，硫酸链霉素的含量为4～8mg，孟加拉红的含量为25～100mg，五氯硝基苯的含量为6～10mg。
本发明在试验的基础上，选定了内生木霉菌杂菌抑制剂氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯的最佳用量配比。具体地，所述专用培养基中氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯的质量比为25:3:25:4。
作为所述分离内生木霉真菌的专用培养基的具体实施方式之一，所述每升(1000ml)pda培养基中，氯霉素的含量为50mg，硫酸链霉素的含量为6mg，孟加拉红的含量为50mg，五氯硝基苯的含量为8mg。
本发明采用的pda培养基配方为马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉12g/l，余量为水，即马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂12g、加灭菌水(或是蒸馏水)至1000ml、自然ph值。
这种pda培养基的具体配制过程为：将200g马铃薯去皮和芽眼，切成小块后放入1000ml的水中一并煮沸至马铃薯变松软而不烂，然后用8层纱布过滤，将滤液重新倒入锅中，加入琼脂粉12g和葡萄糖20g均匀搅拌并补水到1000ml，最后分装于150ml的三角瓶中备用。
本发明还给出了所述分离内生真菌的专用培养基的制备方法，其包括步骤：
1)用马铃薯、葡萄糖、琼脂粉和水制成pda培养基，具体配制过程如上所述；
2)向冷却至45℃左右的pda培养基中加入氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯，混合均匀，制成平板。在添加氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯前，建议将制备的pda培养基冷却至适当温度，便于操作，但这一适当温度应确保pda培养基呈液体状态，本发明限定pda培养基冷却至45℃左右。
本发明对氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯的添加顺序没有特别的限定，而上述组分的含量按本发明设定足量添加，具体地，所述每升pda培养基中，氯霉素的加入量为50～150mg，硫酸链霉素的加入量为4～8mg，孟加拉红的加入量为25～100mg，五氯硝基苯的加入量为6～10mg。氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯的最佳质量比为25:3:25:4。所述平板的制备方法采用现有技术即可满足本发明的需要，在此不做赘述。
另外，本发明还给出了所述分离内生木霉真菌的专用培养基在分离和培养内生木霉真菌上的应用。
作为所述应用的优选实施方式之一，其采用涂抹法分离、培养内生木霉真菌。所述涂抹法采用现有技术即可满足本发明的需要，在此不做赘述。
与现有培养基相比，本发明所述分离内生木霉真菌的专用培养基至少具有下述的有益效果或优点：
本发明所述专用培养基，其组分包括马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯和水；所述马铃薯、葡萄糖、琼脂粉和水制备成pda培养基；在每升pda培养基中，氯霉素的含量为50～150mg，硫酸链霉素的含量为4～8mg，孟加拉红的含量为25～100mg，五氯硝基苯的含量为6～10mg。本发明通过在冷却至45℃左右的pda培养基中加入适量的氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红和五氯硝基苯，制成一种分离内生木霉菌效果较优的选择性培养基。
与分离内生真菌的培养基或土壤木霉菌选择性培养基相比较，本发明所述专用培养基更能高效、快速和准确地分离出内生木霉真菌，分离频率高、杂菌少、分离种类较多，菌落特征明显，易于识别与纯化，专一性强。
本发明所述专用培养基价格低廉，制备方法简单。将本发明所述专用培养基制成平板，再采用涂抹法进行内生木霉真菌的分离，可有效实现内生木霉真菌的简便分离。
具体实施方式
为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果，以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。
实施例1
本实施例给出一种分离内生木霉真菌的专用培养基，其组分包括马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯和水。这种专用培养基的制备方法简要描述如下：
1)配制pda培养基
pda培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂12g、加灭菌水(或是蒸馏水)至1000ml、自然ph值。
pda培养基的具体配制过程：将200g马铃薯去皮和芽眼，切成小块后放入1000ml的水中一并煮沸至马铃薯变松软而不烂，然后用8层纱布过滤，将滤液重新倒入锅中，加入琼脂和葡萄糖均匀搅拌并补水到1000ml，最后分装于150ml的三角瓶中备用。
2)添加杂菌抑制剂
向冷却至45℃左右的pda培养基中加入适量杂菌抑制剂氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯；在每1000mlpda培养基中，氯霉素的含量为50～150mg，硫酸链霉素的含量为4～8mg，孟加拉红的含量为25～100mg，五氯硝基苯的含量为6～10mg。
3)将上述杂菌抑制剂与pda培养基混合均匀，制成平板备用。
实施例2
本实施例给出利用实施例1所述分离内生木霉真菌的专用培养基，进行分离、培养内生木霉菌的常规方法。
首先分别将采集的不同作物(植被)的植株、叶片、根茎等组织样品用自来水冲洗干净，然后在75％的乙醇中浸泡5min，再转入2％次氯酸钠中处理5min，最后用无菌水冲洗3～5次，彻底进行表面消毒。之后，将适量消毒处理过的植株或组织样品放入高速破碎机中打碎成浆，采用平板涂抹法，取汁液(或加30ml灭菌水适当稀释后)均匀涂于本实施例所述专用培养基平板上，每皿25ml培养基用量0.2ml，每处理重复3次，然后将其置于25℃霉菌培养箱中培养3～5d后，挑取内生木霉真菌落进行纯化。
实施例3
本实施例给出采用不同培养基分离内生木霉菌的效果对比。本实施例选用3种常用培养基作为对照(培养基编号1-3)，具体参见表1。根据相关文献资料和预实验，利用分离内生真菌的常规培养基编号1，马丁氏培养基编号2和分离土壤中木霉菌的选择性培养基3以及本发明研制的培养基4，采用组织消毒和涂抹法进行内生木霉菌的分离。
表1不同培养基分离内生木霉真菌的效果测定结果
不同培养基分离内生木霉真菌的效果测定结果(表1)表明，培养基4对细菌和真菌两种杂菌的抑制效果显著，杂菌出现率低，分离出的内生木霉真菌形态特征明显，分离数量较多，分离效果较佳，而培养基1-3分别对细菌或真菌的抑制效果较好，但分离出的内生木霉真菌数量和种类较少，比培养基4分离效果差。因此，初步选择出培养基4作为分离内生木霉真菌效果较佳的培养基。
实施例4
本实施例给出分离内生木霉真菌杂菌抑制剂种类及组合最佳用量选择，分别选用氯霉素(l)、链霉素(sl)、孟加拉红(m)、五氯硝基苯(w)4种杂菌抑制剂在pda培养基上进行木霉真菌分离效果和杂菌抑制效果测定，以选择出分离木霉真菌杂菌抑制剂最佳使用剂量。
表2分离内生木霉真菌不同杂菌抑制剂种类及最佳用量筛选结果
筛选结果(表2)表明：氯霉素(l)、链霉素(sl)、孟加拉红(m)、五氯硝基苯(w)4种杂菌抑制剂在上述用量范围内分别对细菌和真菌具有一定的抑制作用，其中，氯霉素(l)、链霉素(sl)主要抑制细菌生长，五氯硝基苯(w)主要抑制真菌生长，而孟加拉红(m)具有抑制细菌作用和霉菌菌落蔓延生长等多种功能；同时在不同的用量条件下其抑菌效果具有一定的差异性，其中氯霉素、硫酸链霉素、孟加拉红、五氯硝基苯的较适宜用量范围分别为50～100mg、6～8mg、50～100mg、8～10mg。
在表2单因素试验结果的基础上，以氯霉素(l)、链霉素(sl)、孟加拉玫瑰红(m)、五氯硝基苯(w)4种杂菌抑制剂影响因子为靶标，设计l9(34)正交试验因素水平(表3、表4)，通过正交试验进一步测定4种杂菌抑制剂对内生木霉菌的分离效果。
表3正交试验因素水平设计
表4l9(34)不同杂菌抑制剂组合正交试验方案及测定结果
从表4得出，实验组2为最佳的内生木霉菌分离条件，其分离数量最高，而影响因子从高到低依次为m>w>sl>l。
实施例5
在实施例4的基础上，本实施例探究分离内生木霉真菌杂菌抑制剂最优组合。氯霉素(l)、链霉素(sl)、孟加拉玫瑰红(m)、五氯硝基苯(w)4种杂菌抑制剂的组合方案及试验结果见表5。
表5分离内生木霉真菌杂菌抑制剂组合抑制效果试验验证
利用上述正交试验所获得的分离内生木霉真菌最优杂菌抑制剂组合进行抑菌效果验证。从抑菌效果(表5)可以看出，在不同土样的测定中，l+sl+m+w杂菌抑制剂对细菌和真菌的抑制效果均较好，其分离数值均显著低于空白对照，杂菌少，且内生木霉菌的分离数量和种类较多，菌落形态特征明显，易于计数和纯化。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。