一种基于基因组二代测序的大片段缺失的检测方法与流程

本发明涉及一种基于基因组二代测序的大片段缺失的检测方法。

背景技术：

为了快速得到植物理想突变体，研究其重要表型对应的调控网络，可以通过物理或者化学等因素对其种子进行诱变，缩短其突变时间。化学物质诱变，例如诱变剂甲基磺酸乙酯(ems)，可以造成单碱基突变，物理诱变包含各种射线等，例如伽马射线，可对植物dna碱基造成片段缺失。随着二代基因组测序技术成熟和价格进一步下降，基于二代测序技术的混合分组分析(bsa)分析克隆基因的方法较容易实现，此方法相对于传统的图位克隆技术极大的提高了实验效率，目前对二代测序产生的单碱基突变比对技术较成熟，但对于伽马射线造成基因组大片段缺失仍然比较困难，原因主要为二代测序的技术局限性，目前二代测序产生的片段大小为一般为150bp，传统基于二代测序的分析软件对小于150bp的片段缺失分析比较容易，但对于大于150bp甚至大于几十kbp长度的片段缺失锚定区间并非易事，至今没有一款软件能直接分析出大片段缺失的具体位置信息。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于基因组二代测序的大片段缺失的检测方法。

本发明首先保护一种检测植物突变体中基因组片段缺失的方法，包括如下步骤(1)和步骤(2)：

(1)对待测突变体进行全基因组测序；

(2)完成步骤(1)后，对测序结果进行如下步骤(a)-(d)：

(a)将所有reads的完整序列从5’-3’方向切除2/3长度的序列，将剩余的部分比对到植物参考基因组，筛选能100％比对到植物参考基因组上的reads，记录每条read比对的位置；

(b)将步骤(a)筛选得到的所有reads的完整序列从3’-5’方向切除2/3长度的序列，将剩余的部分比对到植物参考基因组，筛选能100％比对到植物参考基因组上的reads，记录每条read比对的位置；

(c)将步骤(b)筛选得到的所有reads的完整序列比对到植物参考基因组，去除能够100％完全比对到植物参考基因组上的reads，其余reads保留；

(d)将步骤(c)保留的所有reads进行如下处理：同一条read经步骤(a)和步骤(b)比对到基因组的位置相减，如果数值大于测序读长的2/3，即存在片段缺失；

所述植物参考基因组为所述突变体植株属于同一种的植物的参考基因组。

所述缺失片段的长度大于100bp。

所述基因组测序具体可采用二代测序。所述二代测序具体可为roch公司的454技术、illumina公司的solexa、hiseq技术和abi公司的solid技术。

所述步骤(2)使用序列比对软件实现；所述序列比对软件为bowtie2。

所述步骤(2)中还包括步骤(e)：经过步骤(d)的分析，对所有存在片段缺失的位点按照大小进行排序，并计算整个基因组的缺失位点数量。

本发明还保护一种用于检测植物突变体中基因组片段缺失的系统，包括全基因组测序仪器、序列比对软件和记载有以上任一所述方法的说明书。所述序列比对软件具体可为bowtie2。

所述缺失片段的长度大于100bp。

以上任一所述突变体可通过多种方式获得，例如从现有突变体库购买具有所述目标表型的的突变体，也可为采用ems(甲基磺酸乙酯)诱变、伽玛射线诱变或者自然突变等方法筛选得到具有所述目标表型的突变体。

本发明还保护以上任一所述的方法在植物突变体基因组分析中的应用。

本发明还保护以上任一所述系统在植物突变体基因组分析中的应用。

本发明还保护以上任一所述的方法在全基因组调控网络研究中的应用。

本发明还保护以上任一所述系统在全基因组调控网络研究中的应用。

以上任一所述植物突变体具体可为水稻突变体。

以上任一所述植物参考基因组具体可为水稻日本晴参考基因组。

采用本发明提供的方法进行大片段(大于100bp的片段)缺失的检测，比对速度快，工作效率提高，本发明分析全基因组大片段缺失可以在1个小时左右完成。可以分析出缺失片段内的候选基因，为调控网络研究奠定基础。本发明填补了二代测序的方法检测基因组大片段缺失技术的空白。

附图说明

图1为水稻kittake和突变体的表型观察结果。

图2为缺失检测验证结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

水稻kittake(粳稻)：具有多分蘖表型；参考文献：李万昌,余娇娇,段灿星,等.灰飞虱胁迫下水稻防卫相关基因的表达[j].作物学报,2012,38(9):1625-1630.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1、诱变材料的获得

1、以水稻kittake种子为原始材料，进行伽马射线诱变(取种子，采用强度为25.00c/kg的伽马射线对种子进行辐射处理)。

2、将步骤1得到的种子播种并培育为植株，植株自交后收获种子(m1代种子)。

3、将步骤2得到的种子播种并培育为植株，植株自交后收获种子(m2代种子)。

4、将步骤3得到的种子播种并培育为植株，从中筛选出分蘖角度为大于20的突变体一株，将其命名为突变体mu1。

水稻kittake和突变体mu1的表型照片见图1。

实际应用中，可以采用任何现有方法获得突变体，例如可以从现有突变体库购买突变体，也可以采用ems(甲基磺酸乙酯)诱变、伽玛射线诱变或者自然突变等方法筛选得到理想的突变体。

实施例2、大片段缺失的检测及分析

1、采用二代测序技术对实施例1得到的突变体mu1进行全基因组测序。可选用roch公司的454技术、illumina公司的solexa、hiseq技术和abi公司的solid技术等二代测序技术进行全基因组测序。

2、完成步骤1后，采用bowtie2比对软件进行比对，方法如下：

(1)从步骤1测序得到的所有完整reads从5’-3’方向切除2/3长度的序列，将剩余的部分序列比对到水稻日本晴参考基因组，筛选能100％比对到水稻基因组上的所有reads序列，并记录每条reads比对的位置；

(2)将步骤(1)筛选得到的所有完整reads从3’-5’方向2/3长度的序列，将剩余的部分序列比对到水稻日本晴参考基因组，筛选能100％比对到水稻基因组上的所有reads序列，并记录每条reads比对的位置；

(3)将步骤(2)筛选得到的所有reads的完整序列比对到水稻基因组，去除能够100％比对到水稻基因组上的reads，排除假阳性，其余reads保留；

(4)将步骤(3)保留的所有reads进行如下处理：同一条read经步骤(1)和步骤(2)比对到基因组的位置相减，如果数值大于测序读长的2/3，即存在缺失；

(5)经过步骤(4)的分析，可以对所有存在缺失的位点按照大小进行排序，并计算整个基因组的缺失位点数量。

经过上述分析，突变体mu1的3号染色体位置1848k-1888k区间缺失39353bp的序列。

3、为了对步骤1和2的结果进行验证，采用引物2f和2r组成的引物对(针对缺失的39353bp片段设计)分别对突变体mu1的基因组dna和水稻kittake的基因组dna进行pcr扩增，将扩增产物进行电泳分析。

2f：5’-tcatgtacttttagcagta-3’；

2r：5’-tttacgagtaatatttcc-3’。

pcr扩增的反应体系：taq酶(takara)0.1微升，10×buffer1微升，dntp(10mm/l)：1微升，模板0.5微升，引物2f(10μm/l)0.5微升，引物2r(10μm/l)0.5微升，水：6.4微升。

pcr扩增的反应条件：首先94℃4分钟，然后94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟共35个循环，最后72℃5分钟。

如果确实有缺失，那么可以在突变体mu1(mutant)中扩增出150bp的片段，而在对照(水稻kittake，wt)中，由于其不存在缺失，pcr产物大小为39353bp，由于片段太大是扩增不出来的，无法通过电泳观察到条带。结果见图2。结果表明，上述基于二代测序的大片段缺失检测方法正确可靠。

利用商购的突变体或其他诱变方法得到的突变体进行大片段缺失检测，经过多次实验验证，均可正确检测突变体的大片段缺失情况，验证了本方法的普适性。