一种基于无猝灭分子信标检测端粒酶活性的方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于无猝灭分子信标检测癌细胞中端粒酶活性的方法。

背景技术：

端粒酶是一种重要的逆转录酶，通过在染色体3'末端加入重复序列(ttaggg)n，来防止天然端粒的缩短。在大多数正常细胞中，端粒酶表达受到严格的抑制，导致端粒随着细胞的分裂而逐渐缩短。与此相反，在85％以上的人类癌细胞中，端粒酶的活性显著上调或激活，其中肺癌，乳腺癌，胃癌，前列腺癌，尿路上皮癌，在细胞永生化中起着重要作用。正常细胞和癌细胞之间端粒酶活性的差异使端粒酶成为癌症诊断的潜在生物标志物。此外，端粒酶活性的抑制可以有效抑制人类癌细胞的生长，甚至导致癌细胞死亡，使端粒酶成为癌症治疗和抗癌药物发现的极具吸引力的靶目标。

端粒酶检测的最大挑战之一是细胞中端粒酶的表达水平极低，因此需要高灵敏度的检测方法。基于聚合酶链式反应(pcr)的端粒重复扩增方法(trap)是端粒酶检测的黄金标准。在trap实验中，合成的端粒酶底物被目的端粒酶拉长，然后通过pcr扩增和定量得到延伸产物。此外，本领域内通过液滴数字pcr、纳米粒子、毛细管电泳和磁珠的结合，提出了一些改进的trap方法，以提高检测的特异性和灵敏度。然而，trap的方法通常需要昂贵的仪器进行热循环，并且pcr诱导往往伴随非特异性放大而产生高背景信号。

除trap方法外，本领域还开发了结合金纳米颗粒(aunp)比色法、ru(bpy)32⁺电化学传感器、全内反射荧光显微单分子计数、端粒酶响应介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)和aunps。然而，上述方法中同样需要合成复杂的纳米材料、表面修饰程序及昂贵的信号采集仪器。由于缺乏有效的信号放大手段，现有技术中的检测手段灵敏度较低，难以满足实际检测需要。因此，开发简单、灵敏的端粒酶检测方法是非常值得的。

肺癌是众多人类癌症类型中最致命的癌症，全世界与癌症相关的死亡率有近25％，5年生存率低于60％。端粒酶可作为肺癌诊断的预后指标，并且在体内使用端粒酶抑制剂grn163l治疗可有效阻止肺癌细胞生长。

分子信标(mb)的检测策略因其简单、灵敏和选择性而广泛应用于生物传感领域。然而，传统的mb探针需要使用有机染料和猝灭剂双重标记发夹末端，这是一个困难且成本昂贵的过程。此外，传统mb探针中使用的有机染料光稳定性差，寿命短。2-氨基嘌呤(2-ap)是腺嘌呤和腺苷的类似物，具有0.65的高量子产率和比有机染料更好的光稳定性和更长的使用寿命。当2-ap与双链dna(dsdna)结合时，由于与相邻碱基的叠加作用，其荧光被高度猝灭。这种独特的2-ap特性推动了无猝灭探针的发展，该探针用于检测dna碱基翻转、dna损伤、核酸构象变化、microrna表达和酶活性。由于因为端粒酶不能直接诱导2-ap荧光的转化，使用2-apmb探针检测端粒酶的研究未见报道。将2-ap荧光探针用于癌细胞中端粒酶活性的检测，对于抗肿瘤药的开发具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术中的空白，本发明提供一种无猝灭分子信标检测癌细胞中端粒酶活性的方法。本发明设计了一种2-氨基嘌呤荧光探针，通过引入核酸底物和kf聚合酶，端粒酶的存在可以促使靶标信号特异性二次放大，释放大量的自由2-ap分子，增强荧光信号，显著提高灵敏度。可实现对单个肺癌细胞中的的端粒酶进行检测，并且无需任何额外的猝灭剂、表面修饰和热循环操作。

为了实现上述技术效果，本发明采用的技术方案为：从癌细胞中提取端粒酶，该端粒酶催化端粒重复单位(ttaggg)n添加到端粒酶底物链的3'端，产生端粒重复的端粒酶延伸产物。随着大片段聚合酶(kf聚合酶，3'→5'exo-)加入，引物沿着模板延伸(即2-apmb)形成双链，从而取代端粒酶的延伸产物。

其中模板序列为：5'-taacactgtctggtaaagatggccctatagtgagtcgtatta-3’。

释放的端粒酶延伸产物可以与其他的2-apmb结合，触发新的聚合反应周期，产生大量的双链。同时，双链中2-apmb的链被t7外切核酸酶降解，导致游离的2-ap分子和引物延伸链都被释放出来，暴露的2-ap分子发出荧光信号，而引物延伸链由于在引物5'端磷酸化修饰而保留，并且与另外的2-apmb结合形成新的双链，引发下一轮t7外切酶降解反应。

本发明中，每一个端粒酶都能触发多次聚合周期，产生大量的双链，而每一条双链又会引发多次降解周期，产生级联放大效应。本发明构建了二次信号放大系统，可以快速释放大量具有强荧光发射的自由2-ap分子，荧光信号稳定，并可通过荧光分光光度计进行监测。

为了实现以上技术目的，本发明第一方面，提供一种无淬灭分子信标荧光探针，该无淬灭分子信标荧光探针为2-氨基嘌呤荧光探针，该荧光探针的序列全长为：5'-aagctgaggtcttgg(2-ap)caccctaaccctaaccctaatgtccaaga-3'。

本发明第二方面，提供一种基于无淬灭分子信标检测端粒酶活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括2-氨基嘌呤荧光探针、端粒酶底物、引物、kf聚合酶、t7外切核酸酶及dntp，其中2-氨基嘌呤荧光探针的序列为：5'-aagctgaggtcttgg(2-ap)caccctaaccctaaccctaatgtccaaga-3'；

端粒酶底物的序列为：5'-aatccgtcgagcagagtt-3'；

引物序列为：5'-t*c*t*tggac-3'，其中*代表硫代修饰。

优选的，上述检测试剂盒中还包括缓冲液。

进一步优选的，该缓冲液包括细胞裂解缓冲液、退火缓冲液、nebuffer2及tris-edta缓冲液。

本发明第三方面，提供一种基于无淬灭分子信标检测端粒酶活性的方法，将酶提取物、端粒酶底物混合孵育得到混合物a，向混合物a中加入2-apmb荧光探针、引物、dntp、kf聚合酶及t7核酸外切酶孵育得到混合物b，并检测混合物的荧光信号强度。

优选的，上述检测方法的步骤如下：

1)端粒酶的提取：一定条件下裂解癌细胞，获取细胞提取物。

2)2-apmb预处理：将单链2-apmb退火形成发夹结构。

3)端粒酶实验反应：将细胞提取物、端粒酶底物及缓冲液混合后孵育，得到端粒酶延伸混合物a；将步骤2)中制备好的2-apmb、引物、dntp、kf聚合酶及t7核酸外切酶加入混合物a中反应一段时间得到混合物b。

4)荧光检测：以氙灯作为激发光源的荧光分光光度计在室温条件下对混合物b进行检测。

优选的，上述步骤1)中将癌细胞采用磷酸盐缓冲液清洗后，经胰蛋白酶消化后收集，向收集得到的细胞中加入裂解缓冲液孵化制备癌细胞提取物。

进一步优选的，人类肺癌细胞株(a549细胞)，人类宫颈癌细胞系(hela细胞)和人类乳房腺癌细胞系(mcf-7细胞)在适宜的湿润环境中培养，细胞用磷酸缓冲盐(ph7.4)清洗两次后，用胰蛋白酶将细胞从培养皿底部消化下来，并将收集的细胞在2000rpm离心机上4℃离心5-20分钟。约1×10⁶个细胞用200μl冷的1×chaps裂解缓冲溶液重悬，在冰上孵化20-40分钟，其次是在4℃、12000rpm离心10-30分钟。离心后，去除上清液快速冷冻和储存在-80℃冰箱中。

更进一步优选的，1×chaps裂解缓冲溶液的组成包括：10mmtris-hcl,ph7.5，1mmmgcl2，1mm[ethylenebis(oxyethylenenitrilo)]tetraaceticacid，0.1mm苯甲脒，5mmβ-mercaptoethanol，3-0.5％(3-cholamidopropyl)-dimethylammoniopropanesulfonate，10％甘油，其体积比为10000：1000：1000：100：5000：5：100。

优选的，步骤2)中单链2-apmb的序列为：5'-aagctgaggtcttgg(2-ap)caccctaaccctaaccctaatgtccaaga-3'；

优选的，步骤2)中单链2-apmb在90-100℃退火5-10分钟。

进一步优选的，10μm单链2-apmb用1×退火缓冲液在90-100℃退火5-10分钟。退火时，缓慢冷却至室温使单链2-apmb形成发夹结构。

进一步优选的，该退火缓冲液的组成为10mmtris-hcl，ph8.0，50mmnacl，10mmmgcl2。

更进一步优选的，上述tris-hcl、氯化钠、氯化镁的体积比为(1:5:1)。

优选的，步骤3)具体操作如下：将步骤1)得到的细胞提取物、端粒酶底物与10×nebuffer2在30-40℃孵育20-40分钟使端粒延伸得到混合物a。将步骤2)制备好的2-apmb、引物、dntp、kf聚合酶、t7核酸外切酶加入混合物a中，在30-40℃反应30-90分钟得到混合物b，在70-85℃灭活10-20分钟。

进一步优选的，20μl反应体系包含1μl细胞提取物，200nm端粒酶底物和2μl10×nebuffer2，得到混合物a后相应的加入200nm2-apmb，200nm引物，500μmdntp，1ukf聚合酶和10ut7核酸外切酶。其中，1单位(1u)是商品化的kf聚合酶所标定的量，与其他物质的量没有换算关系。10个单位(10u)是商品化的t7核酸外切酶所标定的量，与其他物质的量没有换算关系。

优选的，步骤3)中端粒酶底物序列为：5'-aatccgtcgagcagagtt-3'；

引物序列为：5'-t*c*t*tggac-3'，其中*代表硫代修饰。

进一步优选的，nebuffer2的组成为：nacl500mm，100mmtris-hcl，100mmmgcl2，10mmdtt，ph7.9。

更进一步优选的，氯化钠、tris-hcl、氯化镁、二硫苏糖醇的体积比为(50:10:10:1)。

优选的，步骤4)中用340nm的激发波长，在350-550nm的范围内记录荧光光谱。激发和发射狭缝分别设定为5.0和5.0nm。

更进一步优选的，荧光分光光度计为f-7000荧光分光光度计(日本，日立)。

本发明第五方面，提供上述荧光探针及检测试剂盒在检测样品中端粒酶活性方面非疾病诊断治疗目的应用。

优选的，上述样品为癌细胞提取物。

更进一步的，上述癌细胞为肺癌细胞或hela细胞、mcf-7细胞。肺癌细胞可以是a549细胞。

优选的，上述在检测端粒酶活性方面非疾病诊断治疗的应用为检测端粒酶抑制剂活性方面的应用或筛选端粒酶相关药物靶点方面的应用等。

本发明的有益效果

1.针对端粒酶无法直接诱导2-氨基嘌呤荧光转化的技术问题，本发明提供了一种2-氨基嘌呤探针用于端粒酶活性检测的手段，填补了现有技术中的空白。2-氨基嘌呤天然具有荧光活性，其量子产率高，且荧光稳定性良好。本发明方法相比常规分子信标检测，能够省去有机染料和淬灭剂标记发夹的步骤，且荧光稳定性良好，检测也更加方便。

2.本发明中的通过sybrgold染色剂将聚合和降解产物染色，并通过12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析，证实了本发明中的级联信号放大反应只有在端粒酶存在时才会发生，说明本发明的检测方法具有良好的特异性，背景干扰低。

3.现有技术中的分子信标放大反应中，探针与端粒酶延伸产物杂交后经t7核酸外切酶剪切后，生成游离的荧光序列，进行了一级放大。而本发明中引入kf聚合酶，引物沿着模板延伸形成双链，从而取代端粒酶的延伸产物。同时，双链中2-apmb的链可以被t7外切核酸酶降解，游离的2-ap分子和引物延伸链都被释放出来，自由引物延伸链可以与另外的2-apmb结合形成新的双链，引发下一轮t7外切酶降解反应，构建了二次信号放大系统。本发明检测方法可检测单个癌细胞中的端粒酶的活性，如此显著的灵敏度提高是基于现有技术无法预料的，极大提高了端粒酶检测灵敏度，带来了显著的技术进步。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：基于无猝灭分子信标检测癌细胞中端粒酶活的原理图；

图2：端粒酶检测方法特异性验证结果图；

图2a为对端粒酶提取物(相当于20000a549细胞)的反应产物进行12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征。其中，泳道m：dnamarker；泳道1：kfpolymerase；泳道2：telomerase+kfpolymerase；泳道3：kfpolymerase+t7exonuclease；泳道4：telomerase+kfpolymerase+t7exonuclease。所有泳道均被sybrgold染色剂染色。

图2b为不同实验条件下对2-ap分子的荧光检测。a代表kf聚合酶；b代表kf聚合酶+t7外切酶组合，没有明显的荧光信号，表明在端粒酶缺失的情况下没有发生聚合反应或降解反应。c代表端粒酶+kf聚合酶组合，2-ap仍合并在合成的双链中，未观察到荧光信号。d代表端粒酶+kf聚合酶+t7外切酶，检测到高荧光信号，显示端粒酶活化聚合/降解反应的发生，从而释放带有荧光信号的2-aps。

图3：荧光强度与a549细胞个数之间的关系图；

其中，图3a表示不同个数的a549细胞提取物所对应的2-ap荧光发射光谱，随细胞个数的增加，荧光强度随之增强；图3b表示荧光强度(f)和a549细胞个数(n)之间的线性关系。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

图4：端粒酶特异性验证结果图；

检测无任何酶的对照组，端粒酶提取物(相当于20000a549细胞)；cpg甲基转移酶m.sssi；hhai限制性内切酶；甲脒基嘧啶[fapy]-dna糖基酶(fpg)和牛血清白蛋白bsa所对应的荧光强度。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

图5：不同浓度的端粒酶抑制剂对mst-312所对应的端粒酶相对活性的变化图；

端粒酶提取物的个数是20000个。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。图6：不同肿瘤细胞对应的荧光强度图；

实验对象分别为对照组，20000个a549细胞，20000个失活的a549细胞，20000个hela细胞，20000个mcf-7细胞对应的荧光强度。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中尚未开发采用2-氨基嘌呤荧光探针作为分子信标检测端粒酶活性的方法，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种基于无淬灭的分子信标检测癌细胞中端粒酶活性的方法。

如图1所示，本技术方案设计了用于端粒酶检测的2-ap分子信标(2-apmb)探针。2-apmb的环和3’端的柄部分别与端粒酶产物和引物互补。t7外切酶是一种工具酶，通过催化5'到3'方向的双链dna降解，从2-apmb释放2-ap。在端粒酶缺失的情况下，由于存在单链5'突出末端，2-apmb不会被t7外切酶降解。因此，2-ap仍然包含在2-apmb的双链柄部区域，并有效地被相邻的碱基猝灭。相反，目标端粒酶的存在可以催化端粒重复单位(ttaggg)n添加到端粒酶底物链的3'端，产生端粒重复的端粒酶延伸产物。由nupacksoftware计算，2-apmb/端粒酶产物/引物三重杂化比游离的2-apmb(-6.80kcal/mol)自由能低(-34.46kcal/mol)。因此，端粒酶扩增产物倾向于与2-apmb结合展开茎环结构，从而使引物退火到2-apmb，形成2-apmb/端粒酶扩增产物/引物三重杂合体。随着大片段聚合酶(kf聚合酶,3'→5'exo-)加入，引物沿着模板延伸(即2-apmb)形成双链，从而取代端粒酶的延伸产物。释放的端粒酶延伸产物可以与其他的2-apmb结合，触发新的聚合反应周期，产生大量的双链。同时，双链中2-apmb的链可以被t7外切核酸酶降解，而引物延伸链由于在引物5'端磷酸化修饰而保留。结果，游离的2-ap分子和引物延伸链都被释放出来。自由引物延伸链可以与另外的2-apmb结合形成新的双链，引发下一轮t7外切酶降解反应。显然，每一个端粒酶都能触发多次聚合周期，产生大量的双链，而每一条双链又会引发多次降解周期。因此，构建了二次信号放大系统，可以快速释放大量具有强荧光发射的自由2-ap分子，并易于荧光分光光度计进行监测。

如图2所示，目标端粒酶的存在可以催化端粒重复单位(ttaggg)n添加到端粒酶底物链的3'端，产生端粒重复的端粒酶延伸产物，诱导端粒酶活化聚合/降解反应的发生，从而释放带有荧光信号的2-aps是关键点。为了证实这一点，本发明用sybrgold染色剂将聚合和降解产物染色，并通过12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析。如图2所示，加入1μl端粒酶提取物相当于20000个a549细胞，端粒酶提取物和kf聚合酶的存在会产生明显的双链条带(图2a，泳道2)，显示端粒酶引发聚合反应的发生。随着t7核酸外切酶的加入(图2a，泳道4)，端粒酶+kf聚合酶组合时，双链的条带强度降低(图2a，泳道2)表明双链中2-apmb被t7核酸外切酶降解。相反，在缺乏端粒酶提取物，无论是单独kf聚合酶(图2a，泳道1)还是kf聚合酶+t7核酸外切酶(图2a，泳道3)都不可以诱导的双链条带的出现，只有自由的2-apmb和的端粒酶底物被观察到时(引物链太短的凝胶)，表明在缺乏端粒酶时没有反应发生。

为了验证本技术方案用于荧光检测端粒酶活性的可行性，本发明测量在存在和不存在端粒酶时的2-ap的荧光发射光谱。如图2b所示，当存在端粒酶提取物时，比不存在端粒酶时的对照组的荧光强度高3.3倍以上(control)。这些结果清晰地表明本发明提出的方法可用于高效地检测碱性磷酸酶的活性。

如图3所示，为了评估本技术方案检测端粒酶的灵敏度，本发明在最佳实验条件下探究不同个数的a549细胞所对应的荧光强度。图3a为不同个数的a549细胞在0至10000个细胞的范围内对应的荧光发射光谱，图中曲线由下到上细胞个数依次增加。365纳米处的荧光强度随着细胞个数的增加而逐渐增加(图3a)。荧光强度与a549细胞个数从0到10000个范围内呈现良好的线性关系(图3b)。回归方程为f＝135.98+86.23log10n，相关系数(r²)为0.997，其中f为365纳米处的荧光强度，n为a549细胞数。根据3σ/k的方法，检测限(lod)计算为1个a549细胞，其中σ是对照组的标准偏差(sd)，k是线性回归曲线的斜率。值得注意的是，本方法的灵敏度明显优于大多数报道的端粒酶的测定方法。本试验可以在传统trap分析方法中没有热循环参与的等温条件下操作；由于堆积相互作用影响，2-ap在2-apmb中有效淬火，不需要任何额外的猝灭剂；比起以前使用有机染料荧光检验方法，2-ap具有更好的光稳定性和更长的寿命，更好地提高操作能力；该方法不需要对功能性纳米材料和电极进行耗时的合成和修饰。这种超高灵敏度可归因于以下：(1)在没有目标端粒酶的情况下，含有低背景信号的2-ap，(2)端粒酶的存在可以促使靶标特异性二次信号放大，释放大量的自由2-ap分子，增强荧光信号。这足以说明本技术方案的检测灵敏度之高。

如图4所示，为了评估本技术方案的特异性，本发明用hhai限制性内切酶(hhai，5个单位每升)，cpg甲基转移酶(m.sssi，5个单位每升)，甲脒基嘧啶[fapy]-dna糖基酶(fpg，5个单位每升)和牛血清白蛋白(bsa，10毫克每升)作为负对照进行特异性实验。hhai能识别并切割在5'……gcgc……3'链上c和g之间的残基。m.sssi能够特异性地甲基化cpg序列内的所有胞嘧啶残基。fpg从双链dna中移除受损的嘌呤。牛血清白蛋白是一种常用的蛋白。理论上，这些干扰都不能诱导端粒酶底物的延伸，因此不会发生聚合和降解反应，也不能检测到2-ap荧光信号。如图4所示，只有当端粒酶提取物含量达到20000a549细胞时，才能检测到高荧光信号。相反，加入以上的干扰蛋白，仅能产生非常低的荧光信号，与没有任何蛋白加入的对照组(control)相比，荧光强度没有明显变化，由此表明，本技术方案具有高度特异性，能够区分靶标端粒酶和其他不相关蛋白。

如图5所示，为了检测本技术方案能否用于检测端粒酶的抑制剂，本发明使用n,n′1,3-phenylenebis-(2,3-dihydroxy-benzamide)(mst-312)作为抑制剂，mst-312是一种竞争性的端粒酶抑制剂，其通过与酶的活性位点结合有效地抑制端粒酶的活性。端粒酶的相对活性(ra)按照以下方法测量：

ra(100％)＝(fi-f0)/(ft-f0)×100％

其中f0是在没有端粒酶提取物时的荧光强度,ft是存在端粒酶提取物时的荧光强度，fi是端粒酶提取物和抑制剂mst-312同时存在时的荧光强度。随着浓度从0增加到3微摩尔每升，端粒酶的相对活性显著降低。计算得到mst-312的半抑制浓度(ic50，即将端粒酶的活性降低50％所需的抑制剂浓度)为0.62微摩尔每升。值得注意的是，ic50是一个相对值，其值随不同的底物类型和底物浓度的变化而变化，因此它并不是比较不同底物的抑制剂作用的合适参数。这些结果清晰地表明，本发明提出的检测方法对端粒酶的抑制检测具有很高的可靠性和准确性，在抑制剂药物的筛选中具有巨大的潜力。

如图6所示，为了探究本技术方案对实际样品的检测，本发明测量来自人乳腺癌细胞(mcf-7)和人子宫颈癌(hela)细胞这两种不同细胞系的端粒酶的活性。如图所示，与无任何细胞提取物的对照组(control)的低背景信号相比，加入来自mcf-7细胞和hela细胞的提取物时，能够检测到明显增强的荧光信号。很明显，hela细胞提取物的荧光信号比mcf-7细胞提取物的荧光信号高1.6倍，说明端粒酶在不同类型细胞系中的表达水平不同，这与之前报道的结果一致，因此，所提出的方法可用于区分癌细胞和非癌细胞之间的端粒酶的表达。值得注意的是，虽然已经报道了许多方法用来检测活细胞中的端粒酶活性，但是，本发明所提出的方法是首次定量检测端粒酶活性的方法，且检测限极低(1个细胞)。这些结果表明，本技术方案能够高度准确和灵敏地检测癌细胞中内源性端粒酶的活性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

实施例1

1)端粒酶的提取，人类肺癌细胞株(a549细胞)，人类宫颈癌细胞系(hela细胞)和人类乳房腺癌细胞系(mcf-7细胞)在包含10％胎牛血清和1％谷酰胺dmem培养基中与50u/ml青霉素和50mg/ml链霉素在含5％二氧化碳、37℃的适宜的湿润环境中培养；细胞用磷酸缓冲盐(ph7.4)清洗两次后，用胰蛋白酶将细胞从培养皿底部消化下来，并将收集的细胞在2000rpm离心机上4℃离心10分钟。约1×10⁶个细胞用200μl冰冷的1×chaps裂解缓冲溶液重悬，在冰上孵化30分钟，其次是在4℃、12000g离心20分钟。离心后，去除上清液快速冷冻和储存在-80℃冰箱中。热预处理的控制，活跃细胞提取物在85℃加热并提前10分钟测量；

2)将1μm单链2-apmb用退火缓冲液在95℃退火5分钟，其次是缓慢冷却至室温形成发夹结构，并将其存储在-20℃为进一步使用；

3)端粒酶实验反应20μl反应体系包含1μl细胞提取物，200nm端粒酶底物和2μlnebuffer2在37℃孵育30分钟使端粒延伸得到混合物a。然后200nm2-apmb，200nm引物，500μmdntp，1ukf聚合酶和10ut7核酸外切酶被添加到反应溶液中，在37℃反应60分钟得到混合物b，在80℃灭活15分钟。

4)对样品进行荧光测量。荧光光谱用装备有氙灯作为激发光源的f-7000荧光分光光度计在室温下测量。用340纳米的激发波长，在350-550nm的范围内记录荧光光谱。激发和发射狭缝分别设定为5.0和5.0nm。使用365nm处的荧光强度进行实验数据分析，如图2所示。

1×chaps裂解缓冲溶液的组成为：10mmtris-hcl,ph7.5，1mmmgcl2，1mm[ethylenebis(oxyethylenenitrilo)]tetraaceticacid，0.1mm苯甲脒，5mmβ-mercaptoethanol，0.5％3-(3-cholamidopropyl)-dimethylammoniopropanesulfonate，10％甘油)

tris-hcl，mgcl2，ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraaceticacid，苯甲脒，β-mercaptoethanol，0.5％3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]propanesulfonate，10％甘油的体积比为(1000μl，100μl，100μl，10μl，500μl，0.5μl)。

nebuffer2的组成为：nacl500mm，100mmtris-hcl，100mmmgcl2，10mmdtt，ph7.9；氯化钠、tris-hcl、氯化镁、二硫苏糖醇的体积分别为(50μl，10μl，1μl)

双链dna底物储备溶液的制备：

将寡核苷酸用10×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(tris-edta)缓冲液稀释制备储备溶液。1μmol/l的2-apmb双链在退火缓冲液中于95℃孵育5分钟，随后缓慢冷却至室温。形成的双链dna底物储存在4℃使用。

1×退火缓冲液的组成为：10mmtris-hcl，ph8.0，50mmnacl，10mmmgcl2。

tris-hcl、氯化钠、氯化镁的体积分别为0.1μl，5μl，0.1μl。

实施例1为本申请方法的一个举例，以下检测及检验都是在实施例1的基础上，实施例1的端粒酶提取物相当于20000个a549细胞，凝胶电泳，抑制剂测试，动力学分析都是实施例1得到的结果进行测试。

凝胶电泳：

将实施例1步骤3)得到的产物用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶(page)在1×tbe缓冲液(9mmol/l的ph7.9的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)，9mmol/l的硼酸，0.2mmol/l的乙二胺四乙酸)中，于110v恒定电压下进行电泳分析。凝胶通过bio-radchemidocmp成像系统(hercules，ca)成像。

抑制剂测试：

为了检测端粒酶抑制剂的作用，不同浓度的mst-312与a549细胞孵育48h后，收集细胞进行端粒酶检测。实验与上述检测端粒酶的检测方式相同。端粒酶的相对活性(ra)按照以下方法测量：

ra(100％)＝(fi-f0)/(ft-f0)×100％

其中f0是在没有端粒酶提取物时的荧光强度，ft是存在端粒酶提取物时的荧光强度，fi是端粒酶提取物和mst-312同时存在时的荧光强度。根据相对活性(ra)-钒酸钠浓度的曲线计算半抑制浓度(ic50)值。结果如图5所示。

在人胚肾293细胞(hek)和人子宫颈癌(hela)细胞中端粒酶的检测：

将实施例1步骤1)中的一定浓度的端粒酶替换成人乳腺癌细胞(mcf-7)和人子宫颈癌(hela)细胞的提取物，其它步骤相同。

细胞培养和细胞提取物的制备方法：

人类肺癌细胞株(a549细胞)，人类宫颈癌细胞系(hela细胞)和人类乳房腺癌细胞系(mcf-7细胞)在含有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)中，于37℃在含有5％二氧化碳的培养箱中进行培养。细胞数量由countstar细胞计数器测量。用胰蛋白酶消化收集细胞，后用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)洗涤两次，于1000rpm离心5分钟。然后将细胞悬浮在100μl的裂解缓冲液(10mmol/l的ph8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)，150mmol/l的氯化钠，1％的乙基苯基聚乙二醇(np-40)，0.25mmol/l的脱氧胆酸钠，1.0％的甘油和0.1mmol/l的4-(2-胺乙基)苯磺酰氟盐酸盐)中，在冰上孵育30分钟，然后在4℃于12000rpm离心20分钟。将上清液转移到新的离心管中，保存在-80℃。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东师范大学

<120>一种基于无猝灭分子信标检测端粒酶活性的方法

<130>2010

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<170>patentinversion3.3

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