离体验证柑橘柚类S-RNase自交不亲和功能的方法与流程

本发明涉及柑橘种植和育种领域，更特别地，涉及一种离体验证柑橘柚类s-rnase自交不亲和功能的方法。

背景技术：

柑橘柚类(citrusgrandis)属于芸香科柑橘属，具有自交不亲和现象。自交不亲和性状在物种的进化过程中具有重要意义，它促进异交，抑制自交，增加群体多样性。从20世纪90年代开始，对于自交不亲和的研究主要集中在十字花科，罂粟科，以及茄科、蔷薇科、玄参科。在这些植物中存在3类不同的自交不亲和机制，每类机制由不同的基因调控自交不亲和反应。其中在植物中分布最为广泛的一种自交不亲和机制，是以茄科为代表的基于s-rnase介导配子体型机制。

最初，人们通过对不同基因型的烟草花柱蛋白进行提取，利用双向电泳技术找到一个与s2位点紧密连锁的32kda的糖蛋白，而在s3s3植株花柱蛋白中无此蛋白点。mcclureandclarke发现该花柱s糖蛋白与两个真菌中的rnase酶催化域具有同源性。通过高氯酸沉淀方法，从花柱粗蛋白中纯化得到s糖蛋，证明确实具有核糖核酸酶活性，因此命名为s-rnase。之后，在相似的糖蛋白在其他茄科植物中被鉴定，如番茄，土豆，矮牵牛等。在1994年，leed等人首次通过转基因技术证明了该糖蛋白的功能，他们在基因型为s2s3茄科植株中反义抑制s3-rnase表达，最终使得植株丧失拒绝s3花粉的能力。

本课题组的研究发现柑橘柚类也属于由s-rnase介导的自交不亲和类型。由于柚类童期较长，难以通过转基因技术进行功能验证，这也是木本植物基因功能研究的一大难题。

技术实现要素：

为解决以上问题，我们开发了一种研究s-rnase对目标植株花粉的花粉管的生长是否具有抑制作用的方法。

基于以上研究，本发明提供了一种离体验证柑橘柚类s-rnase自交不亲和功能的方法，包括以下步骤：

步骤1：获得受体植株的s-rnase蛋白；

步骤2：从供体植株中采集花粉；

步骤3：用步骤1中得到的s-rnase蛋白处理步骤2中得到的花粉，测定所述s-rnase蛋白的处理对所述花粉萌发花粉管的影响。

在一个优选实施方案中，步骤1包括以下步骤：

步骤11：获得所述受体植株的s-rnase蛋白的dna编码序列；

步骤12：根据所述受体植株的s-rnase蛋白的dna编码序列构建s-rnase蛋白表达系统，表达得到所述s-rnase蛋白。

在一个优选实施方案中，s11中通过对所述受体植株中的s-rnase基因进行测序来得到所述受体植株的s-rnase蛋白的dna编码序列。

在一个优选实施方案中，步骤12包括以下步骤：

步骤121：将所述述受体植株的s-rnase蛋白的dna编码序列克隆到pgex-6p-1中，得到s-rnase蛋白表达质粒载体；

步骤122：将所述s-rnase蛋白表达质粒载体转入蛋白表达用的大肠杆菌中，得到s-rnase蛋白表达菌株；

步骤123：讲所述s-rnase蛋白表达菌株培养至对数期，然后加入iptg诱导表达，从诱导表达的菌体中提取带gst标签的蛋白即所述s-rnase蛋白。

在一个优选实施方案中，步骤2包括以下步骤：

步骤21：从所述供体植株收集成熟花药；

步骤22：处理所述花药，使其释放花粉，收集所述花粉。

在一个优选实施方案中，步骤22中，通过将所述花药在28℃干燥环境下放置1-2天来使其释放花粉。

在一个优选实施方案中，步骤3包括以下步骤：

步骤31：将所述花粉洒在所述花粉液体培养基上培养2h；

步骤32：向步骤31中培养后的花粉培养物中加入所述s-rnase蛋白，继续培养8h；

步骤33：测定培养后的花粉的花粉管长度，根据所述花粉管长度评估供体植株与受体植株之间的自交不亲和性。

在一个优选实施方案中，所述花粉液体培养基包含0.02％mgso4，0.01％kno3，0.03％ca(no3)2，0.01％h3bo3，15％peg-4000和20％蔗糖，ph6.0。

在一个优选实施方案中，步骤3中，所述花粉在28℃黑暗环境中培养。

在一个优选实施方案中，步骤32中添加所述s-rnase蛋白的终浓度为7.5μg/ml。

本发明首次提供了柚类自交不亲和s-rnase的体外表达以及纯化的方法，这不仅可用于该基因离体功能的研究，而且也可用于其抗体的制备，为该基因调控自交不亲和作用机制提供了巩固基础。此外还提供了适合柑橘花粉生长的液体培养基，生长率可达到90％以上，这为柑橘花粉及花粉管的研究提供了有效的手段。

通过本发明的方法，可采取离体培养的方式快速验证柑橘自交不亲和花柱基因，利用合适浓度的重组蛋白处理恰当的花粉，可引起自交亲和或者不亲和反应，避免了柑橘s基因转基因验证的问题。

附图说明

图1为叶片离体接种及保湿培养照片；

图2为高班柚、酸柚、沙田柚以及水晶蜜柚花粉管在不同纯化蛋白离体处理后的生长长度统计。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.沙田柚cgrns1和cgrns2的表达与纯化

1.1表达载体的构建

获得cgrns1和cgrns2的氨基酸序列，分析发现将前21个氨基酸为疏水性信号肽。设计引物，以沙田柚花柱cdna为模板，扩增截去信号肽的cgrns1和cgrns2基因，并在引物中添加带有酶切位点的接头。最终合成引物如下：

6p-rns1-f：5’--gggcccctgggatccaacaattctggttttgaccac--3’(seqidno:1)

6p-rns1-r：5’--gtcgacccgggaattcttaaggcgggggaaaggta--3’(seqidno:2)

6p-rns2-f：5’--gggcccctgggatcctcctcgcaattgttcgacc--3’(seqidno:3)

6p-rns2-r：5’--gtcgacccgggaattcctactcatcggtcggctcg--3’(seqidno:4)。

pcr扩增体系为50μl，包括：25μl2×phantamaxbuffer，1μldntpmix,3μlcdna模板，各2μl的正反引物，以及1μlphantamaxsuper-fidelitydnapolymerase。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物使用1％的琼脂糖胶检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。

使用thermo公司的限制性快速内切酶，bamhi和ecori，对pgex-6p-1进行酶切。酶切体系为2000ngpgex-6p-1质粒，4μlbuffer，各1μl的bamhi和ecori，37℃反应2h。同样对酶切产物进行回收。使用clonexpressiionestepcloningkit进行同源重组，重组体系为2μl5xceiibuffer，50ng线性化pgex-6p-1，10ng基因产物，1μlexnaseii，最后用水补足至10μl，37℃反应30min。反应产物再转入大肠杆菌transt1。挑单克隆进行测序，序列正确的单克隆提取质粒后，转入可以高效表达毒性蛋白或疏水性蛋白的表达菌株overexpressc43(de3)。

1.2诱导表达与纯化

挑取于overexpressc43(de3)中的cgrns1和cgrns2单克隆分别于1ml含卡那霉素的lb中，37℃220rpm摇过夜。按1：100接种到10ml的含卡那霉素的lb中，同样摇过夜。再按1：100接种到1l的含卡那霉素的lb中，37℃220rpm摇od值到0.6。加入0.5mmiptg，放置于20℃摇床，220rpm摇12h。

将摇好的菌5000g低温4℃离心5min收集菌体，每1l的菌用预冷的40mlpbs进行重悬。加入40μl1mpmsf，冰上破碎1h，破4s，停4s。破碎好的菌体，12000g低温4℃离心1h，收集上清于新的管子中。

使用剪去了尖端的枪头吸取800μlglutathionesepharose4bbeads(gehealthcare)琼脂糖填料于10ml空柱，滴去填料中的酒精，先用10ml超纯水洗3遍，再用10ml预冷pbs平衡柱子。将之前得到的上清分次少量的倒入柱子中，每次加入5ml左右，使上清液靠重力自然滴下。

上清全部过柱完成后，再加入预冷的pbs，使用生工的改良型bradford蛋白浓度测定试剂盒进行对滴下的pbs进行染色检测，如果变蓝，说明仍然有杂蛋白，则继续洗，反之则停止。

洗去杂蛋白后，用预冷的pbs配置10mm的还原性谷胱甘肽，并调ph至8.0。使用10ml的该洗脱液进行目的基因的洗脱，洗脱完一次后，用洗脱下的溶液对柱子进行第二次洗脱，以获得最大量的蛋白溶液。对之前实验过程中获得的上清，沉淀以及纯化后的蛋白进行聚丙烯酰胺胶检测，并用考马斯亮蓝染色，判断纯化结果，如图1所示。当检测的纯化结果为单一条带时可以进行下一步实验。

1.3纯化蛋白溶剂置换

为避免pbs或者还原性谷胱甘肽对花粉生长造成影响，配置不含peg4000的花粉液体培养基(0.02％mgso4，0.01％kno3，0.03％ca(no3)2，0.01％h3bo3以及20％蔗糖，ph6.0)。因为peg4000会堵塞超滤管膜。将纯化所得10ml蛋白溶液分批加入50ml10kda的millipore超滤管，使用摇篮式摇床4℃3500g离心30min。将10ml的原溶液浓缩到200μl左右，然后管中加满预冷的花粉培养基(无peg4000)，同样条件离心，再次加满离心，重复操作3次，以达到溶剂置换的目的。最后，将置换好的蛋白保存在小管中，使用nanodrop1000的protein280进行蛋白浓度测定，将浓度调至0.5mg/ml，保存-80℃待用。

2.花粉的培养与处理

2.1柚类花粉采集

选取s基因型为s1s2的沙田柚花粉，s基因型为s1s3的高班花粉，s基因型为s2s9的酸柚花粉，以及s基因型为s5s6的水晶蜜柚花粉。每年3-4月，为柚类开花期，选取天气晴朗，且花含苞待放时，分别收集四种柚类品种的花药。将花药铺在干净的滤纸上，28℃烘1-2天，直至花粉散出。为避免花粉反复解冻而造成活性降低，将烘干的花粉装在200μl的小管中，每个品种的花粉统一装在一个非透明的塑料瓶中，并填埋适量变色硅胶。放于-20℃冰箱保存待用。

2.2srnas处理对花粉管萌发的影响

使用8连管盖作为培养容器，最大限度节约纯化蛋白。将放于-20℃冰箱保存的花粉取出一管，放于室温至少半小时后才可使用。每个管盖先加入的含有15％peg-4000花粉萌发培养基，然后用毛笔均匀的将相应花粉撒于培养基表面。将撒好花粉的八连管盖放于铺有湿润滤纸的黑暗盒子中，置于28℃下培养。培养2h后，再沿壁轻轻加入相应体积的蛋白(体积见表1)，继续在28℃下培养8h。用减去尖端的200μl枪头吸取八连管中培养好的花粉管至载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜拍照观察。每个处理实验，从花粉取出到花粉管拍照，重新独立重复3次。最后用软件imagepro-plus统计花粉管长度，每个重复至少统计100根。

表1花粉的培养与处理方案

理论上，用s蛋白处理具有相同基因型的花粉，花粉管的生长将被抑制。比如用s1蛋白处理纯合基因型s1s1植株的花粉，那么花粉生长都将被抑制；比如用s1蛋白处理纯合基因型s1s2植株的花粉，那么只有一半花粉(携带s1基因型的花粉)的生长将被抑制。根据处理结果图2显示，当单独用cgrns1处理时，高班柚(s1s3)以及沙田柚(s1s2)的花粉管长度相对于未处理的缩短了接近一半，而酸柚(s2s9)以及水晶蜜柚(s5s6)的花粉管长度相对于未处理的只缩短了少许；当单独用cgrns2处理时，酸柚(s2s9)以及沙田柚(s1s2)的花粉管长度相对于未处理的缩短了接近一半，而高班柚(s1s3)以及水晶蜜柚(s5s6)的花粉管长度相对于未处理的只缩短了少许；当用cgrns1和cgrns2处理时，沙田柚(s1s2)的花粉管长度相对于未处理的缩短了超过一半，高班柚(s1s3)以及酸柚(s2s9)的花粉管长度相对于未处理的缩短了接近一半，而以及水晶蜜柚(s5s6)的花粉管长度相对于未处理的只缩短了少许。以上结果和理论相符合，由此说明，cgrns1和cgrns2的确可以引起自交不亲和反应，是控制自交不亲和反应的s基因，并且可以用来鉴定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>离体验证柑橘柚类s-rnase自交不亲和功能的方法

<130>tsbd181-062

<141>2018-10-15

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gggcccctgggatccaacaattctggttttgaccac36

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtcgacccgggaattcttaaggcgggggaaaggta35

<210>3

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gggcccctgggatcctcctcgcaattgttcgacc34

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtcgacccgggaattcctactcatcggtcggctcg35