本发明涉及一种鸭瘟病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种用传代细胞系全悬浮培养鸭瘟病毒的方法，属于兽用生物制品
技术领域：
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背景技术：
：鸭瘟(duckplague，dp)是由鸭瘟病毒(duckplaguevirus，dpv)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性接触性传染病，其特征是流行广泛、传播迅速、发病率高和死亡率高。在国外，荷兰，法国，比利时，印度，美国和英国均有本病发生，在我国江南一带，尤以珠江三角洲养鸭业较发达地区，本病流行广泛，发病率和死亡率高严重威胁养鸭业的发展。目前，防治本病多采用鸡胚弱化毒株接种spf鸡胚或鸡胚成纤维细胞，收获感染的鸡胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合研磨或收获细胞培养基，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成活疫苗，由于该疫苗的生产主要采用传统的鸡胚接种收获尿囊液的方式，但鸡胚生产疫苗需要消耗大量spf鸡胚，生产周期长，易污染，且每枚spf鸡胚一次只能注射一个病毒毒株，尤其是在各类禽病大爆发的时候，该方法无法满足养禽业对于疫苗的需求。细胞悬浮培养是利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是当前国际上生物制品生产的主流模式，其最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。本发明选择鸭胚细胞衍生的传代细胞系，对鸭瘟病毒进行全悬浮培养，不仅病毒滴度高，且可实现大规模全悬浮培养，具有广阔的前景及巨大的社会效益和经济效益。技术实现要素：本发明提供了一种鸭瘟病毒的全悬浮培养方法，鉴于传统ibdv培养方法存在局限性，本发明的目的在于提供用全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞系培养鸭瘟病毒的方法，从而为实现鸭瘟病毒疫苗的大规模生产提供参考。本发明提供了一种鸭瘟病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞的复苏与传代培养。步骤2：采用二阶培养法，向全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞接种鸭瘟病毒，实现病毒大规模培养。步骤3：接毒后，每隔12h取样测定病毒的tcid50，在病毒tcid50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸭瘟病毒。进一步地，所述步骤2的二阶培养法操作方式如下，即全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸭瘟病毒的接种，接毒完成后，将摇瓶放置于5％co2培养箱中，在低转速下吸附0.5h-2h；吸附完成后补加病毒培养基，并放回到5％co2培养箱中，调节合适转速，继续培养。进一步地，本发明的全悬浮培养方法还包括步骤4：取步骤2所得培养后的鸭瘟病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用二阶培养法，将病毒接种至全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞系中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获鸭瘟病毒为鸭胚细胞衍生的传代细胞系的适应毒。进一步地，步骤1所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞系复苏与传代培养方法如下：从液氮中迅速取出鸭胚细胞衍生的传代细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待细胞完全融化后，将复苏细胞加入约20倍体积的细胞培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，使用细胞培养基将细胞吹打重悬均匀，细胞悬液接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养；每隔24h少量取样一次进行细胞计数，通过检查细胞密度和细胞活力等参数，监测细胞生长情况；培养约48-72h，达到一定细胞密度后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。更进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为130rpm-150rpm，优选为150rpm。更进一步地，当鸭胚细胞衍生的传代细胞密度达到6×106/ml-15×106/ml时，可用于鸭瘟病毒的接种，优选的，细胞密度达到8×106/ml～10×106/ml时，用于接毒。更进一步地，鸭瘟病毒接毒量为0.001moi-1moi之间接种，优选的0.01moi。更进一步地，所述的二阶培养法接毒，细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为110rpm-140rpm，优选为110rpm。更进一步地，病毒接种吸附完成后，需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍，优选为补加原工作体积2倍的生产培养基。进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养基中含有10-100mg/l氨基酸、1-10mg/l维生素、100-500mg/l无机盐、1000-8000mg/l葡萄糖、0.01-1mg/l微量元素、0.1-10mg/l生长因子，其中氨基酸选自丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、色氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种，所述维生素选自维生素c、生物素、叶酸、氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、吡哆醛、维生素b12、核黄素、盐酸硫胺素中的一种或多种，所述无机盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的一种或多种，所述微量元素选自硫酸锰、亚硒酸钠、硝酸铁中的一种或多种，所述生长因子选自胰岛素、egf、bfgf中的一种或多种。该培养基属于无血清、化学界定培养基。进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养基中还可含有10-100mg/l氨基酸、1-10mg/l维生素、100-500mg/l无机盐、5000-12000mg/l葡萄糖、0.01-1mg/l微量元素、0.1-10mg/l生长因子、1mol/l的mgcl2、1mg/l脂肪酸，其中氨基酸选自丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、色氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种，所述维生素选自维生素c、生物素、叶酸、氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、吡哆醛、维生素b12、核黄素、盐酸硫胺素中的一种或多种，所述无机盐选自氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的一种或多种，所述微量元素选自硫酸锰、亚硒酸钠、硝酸铁中的一种或多种，所述生长因子选自胰岛素、egf、bfgf中的一种或多种，所述脂肪酸选自硬脂酸和软脂酸。进一步地，所述的鸭瘟病毒为鸭瘟病毒gd株，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。本发明相对于现有技术具有如下有益效果：1、由于鸭瘟病毒宿主范围窄,较难适应传代细胞培养,病毒主要靠鸡胚或鸡胚成纤维细胞培养制备。本发明独创性的使用鸭胚细胞衍生的传代细胞系培养鸭瘟病毒，病毒适应性好，且滴度高，为鸭瘟病毒的培养提供了一种新的、更好的培养基质，解决了鸭瘟病毒无法在传代细胞中培养或培养适应性差的问题。2、本发明通过采用全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞系进行鸭瘟病毒培养，培养过程可实现全悬浮大规模培养，相比传统的鸡胚或鸡胚成纤维细胞培养，大大提高了病毒培养规模和效率，符合未来疫苗培养的必然趋势，具有巨大的应用前景和社会经济效益；3、采用本发明培养的鸭瘟病毒病毒滴度高，免疫原性好，且生产工艺简单，培养周期短，生产效率高，成本大大降低。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。实施例1-3所得鸭瘟病毒的tcid50检测方法如下：将收获的鸭瘟病毒用dmem做10倍系列稀释，取4个适宜稀释度，接种cef(鸡胚成纤维细胞)长满单层的96孔板中，每个稀释度6孔，每孔0.1ml，置37℃孵育120h，根据病变孔计算tcid50。实施例1：不同接毒量及培养时间对鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞系中增殖的影响本发明实施例1所用材料来源如下：1.病毒：鸭瘟病毒gd株，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。2.细胞：全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞。3.第一培养基中含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。4.第二培养基中含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1mol/lmgcl2、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf、1mg/l软脂酸。本发明实施例1鸭瘟病毒的培养方法如下：1.从液氮罐中取出冻存的鸭胚细胞衍生的传代细胞，置于37℃水浴融化后加入到约30ml的第一培养基中，经离心机300g离心10min，去掉上清液，使用125ml三角摇瓶将细胞重悬于15ml的第一培养基中，将培养基置于37℃，5％co2培养箱中，轨道摇床转速设置为150rpm，进行悬浮培养，第一天补充第一培养基15ml，第二天再次补充第一培养基15ml，第三天进行传代；2.对步骤1所得的鸭胚细胞衍生的传代细胞进行细胞密度计数，并接种至三角瓶中，接种密度为0.35×106cells/ml-0.75×106cells/ml，将三角瓶置于37℃，5％co2的培养箱中进行培养，设定轨道摇床转速为150rpm，继续培养2-3天后，重复此方法进行继续传代，对连续传代三代次后的细胞进行扩增，用于病毒接种实验；3.取用第3代扩增至第4代的种子细胞200ml，重复步骤2的操作，使细胞密度达到9.00×106/ml；4.取鸭瘟病毒对步骤3所得细胞株进行病毒的接种，按接毒量分别为1moi，0.1moi，0.01moi，0.001moi分别接种至步骤3中的鸭胚细胞衍生的传代细胞；接毒完成后，放回至37℃、5％的co2培养箱中进行吸附培养1小时，此时轨道摇床转速为120rpm；以第二培养基作为病毒培养基，在吸附完成后补加2倍体积的第二培养基，并放回到33℃、5％co2培养箱中继续培养，轨道摇床转速为130rpm；鸭瘟病毒(中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心，cvccav1222)种毒来源为肇庆大华农生物药品有限公司，毒价为107.5tcid50/0.1ml；5.接毒后每隔12小时取样，进行tcid50的检测。对实施例1取样检测tcid50，结果(表1)如下：表1：不同接毒量对鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中增殖的影响接毒量(moi)tcid50/0.1ml1105.640.1106.330.01107.70.001105.4从表中可以看出，鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的培养受到接毒量的影响，在接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，当接毒量为0.01moi时，所得到鸭瘟病毒的tcid50滴度最高(107.7/0.1ml)，因此后续的鸭瘟病毒传代驯化按此比例进行病毒的接种。实施例2：不同病毒培养基对鸭瘟病毒增殖的影响本发明实施例2所用材料来源如下：1.病毒：由实施例1中收获的tcid50效价最高时的鸭瘟病毒。2.细胞：全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞。3.第一培养基中含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。4.第二培养基中含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1mol/lmgcl2、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf、1mg/l软脂酸。本发明实施例2鸭瘟病毒的培养方法如下：1.对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；2.当步骤1中细胞生长至密度为9×106/ml～12×106/ml时，按接毒量为0.01moi进行鸭瘟病毒的接种，接种的病毒来源为实施例1中收获的tcid50滴度最高时的鸭瘟病毒，将接种后的培养基分为两组，并补加2位体积量的病毒培养基。其中，第一组以无血清，化学成分界定的第一培养基作为病毒培养基进行补加；第二组以无血清，化学成分界定的第二培养基作为病毒培养基进行补加；3.接毒后，每隔12h取样进行tcid50的检测，从而比较不同病毒培养基鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞系中增殖的影响。表2：不同tpck补加策略对鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中增殖的影响组别病毒培养基tcid50/0.1ml1无血清，化学成分界定的第一培养基106.52无血清，化学成分界定的第二培养基107.5如上表中可以看出，通过两种培养基作为病毒生长液生产病毒比较，结果显示：第二培养基病毒的生产效果远远高于第一培养基病毒的生产效果，高达10倍以上，在不对实验过程进行过多更改的前提下通过采用第二培养基有效提高了病毒的生产率，从而降低实验成本，提高病毒的生产效率。本发明后续实施例均采用第二培养基作为病毒培养基使用。实施例3：鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中不同收获时间的tcid50比较本发明实施例3所用材料来源如下：1.病毒：鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的适应毒株。2.细胞：全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞。3.第一培养基中含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。4.第二培养基中含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1mol/lmgcl2、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf、1mg/l软脂酸。本发明实施例3鸭瘟病毒的培养方法如下：1.对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；2.当步骤1中细胞生长至密度为9×106/ml～12×106/ml时，按接毒量为0.01moi进行鸭瘟病毒的接种，接毒方法和病毒培养条件采用的为经实施例1、2、3优化的最佳条件，接毒后72h开始，每隔6h取样进行tcid50的检测，探索鸭瘟在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中的最佳收毒时间。3.对收获的鸭瘟病毒进行tcid50的检测。表3：鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中不同收获时间的tcid50比较收毒时间(h)tcid50/0.1ml72104.878105.184106.290106.896107.5102107.4108107.1114106.8120106.5从表中可以看出，鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中的最佳收毒时间为96h-108h左右。因此，后续的收毒时间定为96h-108h之间。实施例4：鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的传代驯化本发明实施4所用材料来源如下：1.病毒：由上一代次收获的tcid50最高时的鸭瘟病毒作为种毒。2.细胞：全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞。3.第一培养基中含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。4.第二培养基中含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1mol/lmgcl2、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf、1mg/l软脂酸。本发明实施例4鸭瘟病毒的培养方法如下：1.对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；2.当步骤1中细胞生长至密度为9×106/ml～12×106/ml时，按接毒量为0.01moi进行鸭瘟病毒的接种，接种的病毒来源为上一代中收获的tcid50最高时的鸭瘟病毒，接毒方法和病毒培养条件采用的为经实施例1、2、3优化的最佳条件，按此方法连续传代7代次。每次接毒后，每隔12h取样进行tcid50的检测，在tcid50最高时进行鸭瘟病毒收集；3.对收获的鸭瘟病毒进行tcid50的检测。对实施例4取样检测tcid50，结果(表3)如下：表3：鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞系中的连续传代驯化代次tcid50/0.1mlp1106.6p2107.2p3107.5p4107.4p5107.6p6107.3p7107.5从表中可以看出，随着鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的连续传代驯化，鸭瘟病毒能够很好的适应鸭胚细胞衍生的传代细胞，经检测，tcid50最高可107.5/0.1ml，且病毒的滴度稳定。因此选择全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞系作为鸭瘟病毒培养的靶细胞具有非常广阔的前景。综上所述，本发明实施例通过以鸭胚细胞衍生的传代细胞系作为鸭瘟病毒的靶细胞，既可解决鸭瘟病毒无法在传代细胞中培养或培养适应性差的问题，同时本发明采用无血清化学界定的个性化培养基又可实现鸭瘟病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的全悬浮培养，大大提高了病毒培养规模和效率，符合未来疫苗培养的必然趋势。更重要的是，根据申请人的测试，鸭胚细胞衍生的传代细胞系不仅可用于培养鸭瘟病毒，鸡新城疫、禽流感病毒同样在鸭胚细胞衍生的传代细胞系中具有良好的适应性，因此，如果要生产细胞源多联苗时，可以解决生产联苗需要用多种细胞、工艺复杂、很难保证批次稳定性等问题。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。当前第1页12