本发明属于饲料添加剂合成
技术领域：
，具体涉及一种三氮唑类脲酶抑制剂型饲料添加剂及其制备方法。
背景技术：
：脲酶又称尿素水解酶，它是一种含镍寡聚酶，具有绝对的专一性，它可以特异性地催化脲水解为氨和二氧化碳，其水解产物氨可以为许多微生物体和植物的新陈代谢提供氮源，并对它们周围环境的ph值起着关键性调节作用；同时，这也引起自然界中许多负面效应。如脲酶可过度催化降解尿素生产挥发性的氨气和二氧化碳，而引起氮肥肥效的丢失和导致土壤中氨离子浓度增加及ph值升高，影响植物的正常生长；脲酶也可作为一种病原体的毒素引发胃炎、胃溃疡及胃癌等疾病。如幽门螺杆菌利用自身产生的大量脲酶去催化水解脲，导致其周围的ph值升高，来抵抗胃酸的杀灭作用。因此，有必要寻找合适的脲酶抑制剂来科学调控脲酶的活性，消除其产生的负面效应，目前已报到的脲酶抑制剂主要有两类，分别为过渡金属离子类脲酶抑制剂和有机化合物类脲酶抑制剂，前者由于重金属离子具有较大的毒性，而受到一定的应用限制；后者又因有效抑制时间短、效率低及有毒副作用，应用上也有局限性。如果把有机小分子和重金属离子形成配合物后，有机配体和金属离子均被固定在配合物骨架中，其毒性大大降低，发挥作用时间也会延长，具有很好的潜质。反刍动物胃内广泛存在脲酶，它分解尿素为nh3的速率是未经催化分解的1014倍，是瘤胃微生物利用nh3的速率的4倍，极大地降低了氮素的利用率，通常只有30％～40％，这不仅造成农牧业资源的严重浪费，增加生产成本，而且对动植物的生长和生态环境等也有严重的危害，并会引起严重的水源污染和水体富营养化等。因此，如何解决脲酶所引起的经济、环境和健康等问题，已成为当今世界经济和农业、畜牧业可持续发展中的一个迫切需要解决的挑战性课题。三氮唑及其衍生物作为一类五元氮杂环你化合物，不仅具有配位点多、配位能力强及体积小的优点，而且显示出优异的生物活性，例如抗菌性、抗肿瘤以及抗炎等活性，目前以后大量的三氮唑及其配合物用于生物活性等方面的研究。铜是仔猪生长发育不可或缺的微量元素，铜元素是饲料原料中自然存在的微量元素。在动物体内，铜存在于酶和骨胶原中，不仅参与血红蛋白和红细胞的合成，还对生殖功能和心脏功能产生作用。此外，有研究显示铜元素能抑制肠道有害微生物菌群，促进有益微生物菌群的生长，改变肠道微生物结构，从而促进机体生长。因此，我们在三氮唑化合物上进行了修饰，使其与铜离子进行了配位络合，合成了一种结构新颖的唑类化合物，该化合物能够作为非蛋白氮，并且可以对脲酶具有一定抑制作用，并且具有杀菌抗溃疡的作用，可作为优异的动物饲料添加剂。技术实现要素：本发明解决的技术问题是提供了一种合成方法简单、原料价格低廉，结构新颖的三氮唑唑类脲酶抑制剂型饲料添加剂及其制备方法。本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种三氮唑类脲酶抑制剂型饲料添加剂的结构为：本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种唑类脲酶抑制剂型饲料添加剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：(1)、向反应瓶中分别加入载体和硝酸钠，并缓慢倒入浓硫酸，搅拌均匀后加入高氯酸，升温至40℃搅拌一段时间，再加入去离子水，升温至90℃搅拌一段时间后冷却至室温再加入适量去离子水、过氧化氢，静置沉淀，然后洗涤离心数次，连续超声，冷冻干燥得到氧化载体；把制得的氧化载体溶于n,n-二甲基甲酰胺溶液中，进行超声分散，称量五水合硝酸铋和六水合硝酸钪溶于n,n-二甲基甲酰胺中，称取三氟甲基磺酸钠溶于乙二醇，将上述溶液混合，搅拌一段时间后倒入聚四氟乙烯高压水热釜内，加热至140℃反应一段时间后自然冷却至室温，用乙醇与去离子水交替洗涤并离心，将沉淀物至于80℃鼓风干燥箱中干燥得到复合催化剂；所述的载体为石墨粉；所述的五水合硝酸铋与三水合硝酸钪的投料量摩尔比为1:0.5～1.0。(2)、在高压反应釜中，氩气保护下，在内温5～10℃条件下把1,3-二氯苯加入三氟乙酸酐，甲酸和二甲基亚砜的混合溶液中，保持温度不变，加入一定量的复合催化剂，缓慢升温至90℃搅拌一段时间后向反应釜内通入氨气，使釜内压力达到0.1mpa，保持压力不变，继续升高温至140℃，反应至tlc监控原料反应完全，冷却至室温，过滤反应液，滤液加入水，用二氯甲烷萃取多次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后浓缩得到3,5-二氯苯甲酰胺；所述的1,3-二氯苯与三氟乙酸酐和甲酸的投料量摩尔比为1:2:2；所述的1,3-二氯苯与复合催化剂的投料量质量比为100:5。(3)把3,5-二氯苯甲酰胺和苄胺加入到n,n-二甲基甲酰胺中，加热到100℃，反应至原料消失，反应液冷却到室温，倒入水中，用乙酸乙酯萃取反应液多次，合并有机相，经无水硫酸镁干燥后，浓缩得到3,5-二苄胺基苯甲酰胺；所述的3,5-二氯苯甲酰胺与苄胺的投料量摩尔比为1:2.5。(4)把3,5-二苄胺基苯甲酰胺和钯碳加入到甲醇中，高压釜内通入氢气，压力达到0.2mpa，反应温度为40℃，反应至原料反应完全，过滤反应液，滤液浓缩得到3,5-胺基苯甲酰胺。(5)把三氯氧磷加入到二氯甲烷中，在恒压滴液漏斗中加入溶有3,5-胺基苯甲酰胺的二氯甲烷混合溶液，在氮气保护下，在室温条件下滴加混合液，滴加完后，继续搅拌至原料反应完全，向反应瓶中通入氨气，有插入反应液的温度计可观察，反应温度急剧升高，然后迅速下降，反应温度下降到室温时，反应结束，过滤反应液，有机相经无水硫酸镁干燥后浓缩得到3,5-二甲基脲基苯甲酰胺。(6)将3,5-二甲基脲基苯甲酰胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，配置成溶液a；把溴丙炔和三乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，配置成溶液b；把溶液a和溶液b通过四氟泵送入反应温度为40℃的碳化硅反应器中，物料在微反应器中在一定停留时间内发生取代反应，收集反应后的物料，把得到的全部反应液倒入水中，用氯仿萃取反应液多次，合并有机相，浓缩后得到n-丙炔基-3,5-二甲基脲基苯甲酰胺；所述的停留时间为3～6min。(7)在反应瓶中把n-丙炔基-3,5-二甲基脲基苯甲酰胺，碘化亚铜加入n,n-二甲基甲酰胺和甲醇的混合溶液中，氮气保护，开始搅拌，再加入叠氮基三甲基硅烷，升温到95℃反应至原料反应完全，水洗后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂，硅胶柱层析分离得n-((1h-1,2,3-三氮唑-4-基)-3,5-二甲基脲基苯甲酰胺。(8)取硝酸铜溶于乙腈中，把n-((1h-1,2,3-三氮唑-4-基)-3,5-二甲基脲基苯甲酰胺溶于乙醇中，将上述溶液混合后加热至一定温度，搅拌一段时间后冷却至室温，再加入无水乙醚，静置放置缓慢挥发直至析出晶体，抽滤反应液，得到配合物所述的反应温度为70℃。本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种唑类脲酶抑制剂型饲料添加剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：具体实施方式以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。实施例1向反应瓶中分别加入石墨10g和硝酸钠10g，至于0℃条件下缓慢加入浓硫酸150ml，机械搅拌10min，加入高氯酸50g，升温至50℃，搅拌1h，加入去离子水500ml，升温至80℃，搅拌50min，取出反应瓶室温下加入去离子水200ml和过氧化氢100ml，静置沉淀冷却至室温，洗涤离心数次，连续超声8h，冷冻干燥10h既得氧化石墨；把所得氧化石墨全部加入n,n-二甲基甲酰胺60ml中，进行超声分散，称量五水合硝酸铋4.8g和六水合硝酸钪2.3g溶于n,n-二甲基甲酰胺40ml中，称取三氟甲基磺酸钠10g溶于乙二醇40ml后搅拌1.5h将上述溶液混合，搅拌1h后停止。将混合后溶液倒入聚四氟乙烯高压水热釜内，140℃水热反应24h，反应停止后自然冷却至室温，用乙醇与去离子水交替洗涤并离心。将沉淀物至于80℃鼓风干燥箱中干燥12h，得到石墨负载铋/钪催化剂a14.9g。实施例2向反应瓶中分别加入石墨10g和硝酸钠10g，至于0℃条件下缓慢加入浓硫酸150ml，机械搅拌10min，加入高氯酸50g，升温至50℃，搅拌1h，加入去离子水500ml，升温至80℃，搅拌50min，取出反应瓶室温下加入去离子水200ml和过氧化氢100ml，静置沉淀冷却至室温，洗涤离心数次，连续超声8h，冷冻干燥10h既得氧化石墨；把所得氧化石墨全部加入n,n-二甲基甲酰胺60ml中，进行超声分散，称量五水合硝酸铋4.8g和六水合硝酸钪1.2g溶于n,n-二甲基甲酰胺40ml中，称取三氟甲基磺酸钠10g溶于乙二醇40ml后搅拌1.5h将上述溶液混合，搅拌1h后停止。将混合后溶液倒入聚四氟乙烯高压水热釜内，140℃水热反应24h，反应停止后自然冷却至室温，用乙醇与去离子水交替洗涤并离心。将沉淀物至于80℃鼓风干燥箱中干燥12h，得到石墨负载铋/钪催化剂b11.6g。实施例3在高压反应釜中，氩气保护下，开动冷却，内温5～10℃，把1,3-二氯苯15g加入三氟乙酸酐42g，甲酸9.2g和二甲基亚砜150ml的混合溶液中，保持温度不变，加入石墨负载铋/钪催化剂a0.7g；缓慢升温至90℃搅拌50min，向反应釜内通入氨气，使釜内压力达到0.1mpa；保持压力不变，继续升高温至140℃，反应2h后tlc监控原料反应完全，冷却至室温，过滤反应液，滤液加入水100ml，用二氯甲烷100ml萃取多次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后浓缩得到3,5-二氯苯甲酰胺13g；anal.calcdforc7h5ncl2o:c,44.24；h,2.65；n,7.37.found:c,44.51；h,2.69；n,7.32。实施例4在高压反应釜中，氩气保护下，开动冷却，内温5～10℃，把1,3-二氯苯15g加入三氟乙酸酐42g，甲酸9.2g和二甲基亚砜150ml的混合溶液中，保持温度不变，加入石墨负载铋/钪催化剂b0.7g；缓慢升温至90℃搅拌50min，向反应釜内通入氨气，使釜内压力达到0.1mpa；保持压力不变，继续升高温至140℃，反应2h后tlc监控原料反应完全，冷却至室温，过滤反应液，滤液加入水100ml，用二氯甲烷100ml萃取多次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后浓缩得到3,5-二氯苯甲酰胺9g；anal.calcdforc7h5ncl2o:c,44.24；h,2.65；n,7.37.found:c,44.51；h,2.69；n,7.32。实施例5在反应瓶中，把3,5-二氯苯甲酰胺19g和苄胺25g加入到n,n-二甲基甲酰胺130ml中，加热到100℃，反应1h后tlc监控显示原料消失，反应液冷却到室温，倒入水100ml中；用乙酸乙酯100ml萃取反应液三次，合并有机相，经无水硫酸镁干燥后，浓缩得到3,5-二苄胺基苯甲酰胺31g；1hnmr(400m,cdcl3):7.98(s,2h),7.74(d,j＝2.0hz,2h),7.49(d,j＝2.0hz,4h),7.33-7.32(m,2h),7.27(s,2h),6.89(s,2h),6.77(s,1h),4.38(s,4h)；ms(esi)m/z:332.4[m+h]+.anal.calcdforc21h21n3o:c,76.11；h,6.39；n,12.68.found:c,76.35；h,6.32；n,12.57。实施例6在500ml反应瓶中，把3,5-二苄胺基苯甲酰胺33g和钯碳(含量5％)1.6g加入到200ml甲醇中，高压釜内通入氢气，压力达到0.2mpa，反应温度为40℃，反应12h后经tlc监控原料反应完全，过滤反应液，滤液浓缩得到纯净的3,5-胺基苯甲酰胺12g；anal.calcdforc7h9n3o:c,55.62；h,6.00；n,27.80.found:c,55.83；h,6.13；n,27.54。实施例7在反应瓶中，把三氯氧磷30g加入到二氯甲烷300ml中，在恒压滴液漏斗中加入溶有3,5-胺基苯甲酰胺15g的二氯甲烷100ml混合溶液，在氮气保护下，在室温条件下滴加混合液，滴加完后，继续搅拌1h，tlc监控原料反应完全，向反应瓶中通入氨气，有插入反应液的温度计可观察，反应温度急剧升高，然后迅速下降，反应温度下降到室温时，反应结束，过滤反应液，有机相经无水硫酸镁干燥后浓缩得到3,5-二甲基脲基苯甲酰胺29g；anal.calcdforc7h15n7o2p2:c,27.37；h,4.92；n,31.92.found:c,27.14h,4.81；n,31.76。实施例8将3,5-二甲基脲基苯甲酰胺31g溶于n,n-二甲基甲酰胺200ml中，配置成溶液a；把溴丙炔12g和三乙胺12g溶于n,n-二甲基甲酰胺100ml中，配置成溶液b；把溶液a和溶液b分别以流速10ml/min和5ml/min通过四氟泵送入反应温度为40℃的碳化硅反应器中，物料在微反应器中发生取代反应，并且其停留时间为3min，收集反应后的物料，把得到的全部反应液倒入水中，用氯仿200ml萃取反应液4次，合并有机相，浓缩后得到n-丙炔基-3,5-二甲基脲基苯甲酰胺32g；1hnmr(400m,dmso-d6):8.41(s,1h),7.22(s,2h),6.97(s,1h),4.55(d,j＝8.0hz,2h),4.16(s,2h),3.25(s,1h),2.13-2.11(m,8h)；ms(esi)m/z:346.2[m+h]+.anal.calcdforc10h17n7o3p2:c,34.79；h,4.96；n,28.40.found:c,34.61h,4.92；n,28.55。实施例9将3,5-二甲基脲基苯甲酰胺31g溶于n,n-二甲基甲酰胺200ml中，配置成溶液a；把溴丙炔12g和三乙胺12g溶于n,n-二甲基甲酰胺100ml中，配置成溶液b；把溶液a和溶液b分别以流速10ml/min和5ml/min通过四氟泵送入反应温度为40℃的碳化硅反应器中，物料在微反应器中发生取代反应，并且其停留时间为6min，收集反应后的物料，把得到的全部反应液倒入水中，用氯仿200ml萃取反应液4次，合并有机相，浓缩后得到n-丙炔基-3,5-二甲基脲基苯甲酰胺27g；1hnmr(400m,dmso-d6):8.41(s,1h),7.22(s,2h),6.97(s,1h),4.55(d,j＝8.0hz,2h),4.16(s,2h),3.25(s,1h),2.13-2.11(m,8h)；ms(esi)m/z:346.2[m+h]+.anal.calcdforc10h17n7o3p2:c,34.79；h,4.96；n,28.40.found:c,34.61h,4.92；n,28.55。实施例10在反应瓶中加入n-丙炔基-3,5-二甲基脲基苯甲酰胺3.5g，碘化亚铜0.15g和n,n-二甲基甲酰胺和甲醇的混合液30ml(vdmf：vch3oh＝2:1)，氮气保护，开始搅拌，再加入叠氮基三甲基硅烷1.5g，升温到95℃，搅拌24h，降温，加入水20ml，乙酸乙酯30ml萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂，硅胶柱层析(vch3oh：vdcm＝1:15)，得n-((1h-1,2,3-三氮唑-4-基)-3,5-二甲基脲基苯甲酰胺3.6g；1hnmr(400m,dmso-d6):11.17(s,1h),8.09(d,j＝8.0hz,1h),7.66(s,1h),7.04-7.02(m,1h),6.83-6.82(m,2h),4.68(d,j＝8.0hz,2h)，4.15(s,2h),2.17-2.15(m,8h)；13cnmr(100m,dmso-d6):166.5,147.1,136.2,129.4,128.8,107.9,102.3,56.5；ms(esi)m/z:389.1[m+h]+.anal.calcdforc10h18n10o3p2:c,30.93；h,4.67；n,36.08.found:c,30.84；h,4.75；n,36.27。实施例11取硝酸铜19g溶于300ml乙腈中，39g溶于乙醇600ml中，将上述溶液混合后加热至70℃，搅拌30min后冷却至室温，再加入无水乙醚1000ml，静置放置缓慢挥发，两天后瓶中出现晶体，抽滤反应液，得到配合物35g。元素分析通过元素分析仪测定碳、氢、氮的含量，通过铜氨络合法测定铜离子的含量，元素分析结果见表1。表1配合物元素分析结果结论：样品的元素分析结果与理论值符合。实施例12体外脲酶抑制实验牛饲喂1h后，用特制瘤胃液采集器经人工瘤胃瘘管采集瘤胃液400ml，通过4层纱布过滤后备用。每个培养管按表1中的量加入相应的试剂后，滴加4滴液体石蜡，置(39.0±0.5)℃恒温水浴振荡器上轻摇。分别在培养的1,2,4,6和8h，从各组取出部分培养管，立即加入4滴饱和氯化汞溶液并摇匀，以终止反应。用凯氏半微量-饱和氧化镁蒸馏法测定各管氨态氮含量。抑制率(％)＝(对照组氨含量-试验组氨含量)÷对照组氨含量×100％时间(h)对照组抑制率试验1组抑制率试验2组抑制率试验3组抑制率10％16.3％21.9％39.6％20％26.8％29.4％49.1％40％43.4％48.2％60.4％60％52.7％61.8％71.9％80％59.3％69.5％80.5％实施例13生物活性测定我们选用大肠杆菌(革兰氏阴性短杆菌)和金黄葡萄糖球菌(革兰氏阳性菌)作为抗菌活性测试对象。首先是制备液体培养基(将蛋白胨1g、酵母膏0.5g、氯化钠1g、蒸馏水100ml置于250ml锥形瓶中，放在电炉上边搅拌边加热，待混合澄清均匀时，停止加热，将瓶口用纱布和牛皮纸依次封口待用)和固体培养基(将蛋白胨1g、酵母膏0.5g、氯化钠1g、琼脂2g、蒸馏水100ml置于250ml锥形瓶中，放在电炉上边搅拌边加热，待混合澄清均匀时，停止加热，将瓶口用纱布和牛皮纸依次封口待用)；然后通过高压灭菌锅对培养基进行灭菌处理。其次是菌液的制备，把大肠杆菌和金黄葡萄糖球菌菌种活化后，用移液枪移取100μl活化后的菌液，置于灭完菌的100ml蒸馏水中混合均匀。最后通过紫外灯对平板进行灭菌，然后趁热将培养基快速倒入平板中，厚度约0.15cm，均匀铺平，静置，让其缓慢凝固，凝固后放入37℃的保温箱中培养一天做无杂菌检测。用dmf分别配置所合成的目标化合物及对照化合物溶液，置于容量瓶中待用。用打孔器在滤纸上打孔，孔径为5mm，然后将滤纸片灭菌后浸泡在浓度为1mg/ml的样品溶液中待用。在超净工作台上，点燃酒精灯，用移液枪取10μl稀释的培养液加到固体培养基表面，并涂布均匀。用无菌镊子取浸泡过的园滤纸片铺到培养基表面。每个平板放4片，进行3次平行实验，其中一片进行空白对照。将放有药片的平板置于37℃恒温箱中培养24h，观察现象。通过琼脂培养基上分别出现不同大小的透明圆环-抑菌圈，通过测量抑菌圈直径就可以看出各样品的抑菌活性大小。实施例14新型饲料添加剂依据新兽药一般毒性试验技术要求和gb15193.3-2003进行经口急性毒性试验：在预试验基础上，分别用20只小鼠和20只大鼠，采用间隔4h两次经口灌服，给药剂量均为16.0g/kg，给药体积为0.2ml/10g体重，结果在14d内动物采食、饮水、粪便及行为均正常，未见任何毒性反应，新型饲料添加剂对小鼠和大鼠口服ld50均大于16.0g/kg。以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。当前第1页12