一种采用米曲霉发酵生产乳糖酶的方法及其所产乳糖酶与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种采用米曲霉发酵生产乳糖酶的方法及其所产乳糖酶。

背景技术：

乳糖酶，是一种无味、无嗅，溶解后为浅棕色液体，且无毒无副作用的生物酶制剂，该酶可用于降解乳糖为半乳糖和葡萄糖，亦具有半乳糖苷的转移作用。同时也是哺乳动物乳汁中一种重要的营养成分。可催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，多用于乳品工业。哺乳动物的乳糖酶活性随年龄增长具有典型的生理性降低，所以乳糖酶缺乏是广泛存在的世界性问题。

乳糖酶存在于扁桃、杏等植物及幼小哺乳动物的小肠中，细菌、霉菌和酵母等微生物经发酵亦可产生乳糖酶。目前只有来源于微生物的乳糖酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取乳糖酶，具有酶源丰富、产量高、生产成本低、周期短的特点，而且不受季节、地理位置等因素的影响。不同微生物来源的乳糖酶的性质差别较大，其中细菌中的乳酸菌、环状芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、产气肠细菌等；霉菌中的米曲霉、黑曲霉、硫球曲霉、黄青霉、炭色曲霉等；酵母中的脆壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母等；放线菌中的天蓝色链霉菌等均产乳糖酶。目前商业用酶源一般认为酵母(如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母)最为安全，另一种为黑曲霉和米曲霉。

乳糖酶根据不同来源可分为胞内酶或胞外酶，如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根酶等产乳糖酶均为胞外酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌产胞内酶。霉菌作用最适ph偏酸性，酵母和细菌所产乳糖酶最适ph近中性。因此最适ph决定了各自的用途，如霉菌所产乳糖酶适用于酸性乳清和干酪的水解(含大量乳糖)，酵母和细菌乳糖酶适于牛乳(ph6.6)和鲜乳清(ph6.1)的水解。微生物乳糖酶最适作用温度范围较宽，酵母乳糖酶作用温度在35℃左右，而霉菌最适作用温度一般在50℃以上，最高可达60℃、环状芽孢杆菌则可达65℃、嗜热水生菌则为80℃、耐高温微生物菌株使用时可避免杂菌污染。大肠杆菌乳糖酶分子质量最大为520-850kd，亦有报道为500-520kd。

有关乳糖酶在食品工业中的应用研究引起了人们的极大关注，已经成为食品生物技术领域的新热点之一。国外从上世纪60年代，国内从80年代进行了大量的工作，但目前国内和国外还存在着很大的差距，乳糖酶并未在中国食品和乳品工业中得到广泛应用，主要原因是乳糖酶的单位产量较低，市场上销售的乳糖酶多为胞内酶，需破碎细胞才能得到，提取纯化工艺复杂，成本高、酶的作用温度低，耐热性差，工业生产中很容易染菌，适用范围窄。乳糖酶主要应用于食品、医药方面，对工程菌可能的潜在危害，各国态度不一，其安全性有待于进一步提高。在解决这些问题的过程中，高温乳糖酶受到了普遍关注，筛选作用温度高、热稳定性好、对乳糖有较高活性的乳糖酶产生菌对大规模推进工业化生产有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种采用米曲霉发酵生产乳糖酶的方法及其所产乳糖酶，在确保米曲霉发酵高产乳糖酶稳定性的同时，显著提高乳糖酶良好的耐热性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现目的：

一株高产乳糖酶的米曲霉，所述菌株为米曲霉(aspergillusoryzae)ca-08，菌株保藏号为cgmccno.14137。

所述米曲霉ca-08发酵所产的乳糖酶最适作用ph范围为4.0-7.0，最适作用温度为80℃，在80℃保温1h后剩余酶活为89％。

本发明的另一目的在于提供上述米曲霉ca-08的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：

斜面培养：挑取一环米曲霉ca-08接种于固体斜面培养基，30℃下恒温培养36h，得一级种子；

摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温30℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；

种子罐培养：将二级种子液按照接种量15％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温30℃，转速200r/min条件下培养45h；

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量6-8％(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温30-32℃，转速200-220r/min，设置通风量：1-2vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液ph值为5.5-5.8，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为105h，得到最终发酵液；

进一步地，最终发酵液中乳糖酶酶活为101000u/ml至103000u/ml；

将最终发酵液通过提取与精制方法，获得乳糖酶成品液体酶制剂。

所述斜面培养基(g/l)：麦汁培养基，8-10°bé麦汁，琼脂15-20，ph5.5-5.8，121℃灭菌20min；

所述种子培养基(g/l)：葡萄糖20-25，蛋白胨4-6，磷酸二氢钾1.3-1.8，硫酸镁0.8-1.2，ph5.5-5.8，121℃灭菌20min。

所述种子罐培养基(g/l)：葡萄糖60-90，酵母膏3-6，玉米浆3-5，硫酸铵0.8-1.2，硫酸镁0.6-1.0，磷酸二氢钾1.2-1.8，氯化钙0.5-1.2，ph5.5-5.8，121-123℃灭菌30min；

所述发酵罐培养基(g/l)：麦芽糖80-120，豆饼粉25-40，玉米浆25-30，硫酸镁1.8-2.2，硫酸铵4-5.5，磷酸二氢钾4-6，氯化钙0.5-1.2，ph5.5-5.8，121℃灭菌30min。

所述补料培养基(g/l)：麦芽糖150-300，玉米浆20-30，硫酸镁1.8-2.5，121℃灭菌30min。

所述乳糖酶的提取与精制方法如下：

先将最终发酵液加入1～5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

在所述浓缩液中加入20％(m/v)稳定剂、0.45％(m/v)防腐剂，调节ph5.5，然后进行过滤除菌，即得到乳糖酶成品液体酶制剂。

优选地，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为质量比为1：2的山梨酸钾和苯甲酸钠。

本发明所述的米曲霉ca-08是通过对米曲霉原始菌株aj2010进行co60射线诱变处理得到的，所述的米曲霉ca-08已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmccno.14137保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

有益效果：

本发明通过对米曲霉原始菌株aj2010进行co⁶⁰射线诱变处理诱变选育了一株高产乳糖酶的突变菌株ca-08，并对米曲霉ca-08发酵过程进行补料条件优化使其发酵液酶活达到101000u/ml至103000u/ml之间，而米曲霉原始菌株aj2010通过液态发酵后最高酶活为89500u/ml。由此可以看出，米曲霉ca-08显著高于米曲霉原始菌株aj2010的酶活。

本发明菌株的发酵方法中培养基成分均来源于成本较低的原料，且在提高发酵产能、提升生产效率的同时，大大减少发酵成本，对生产具有极大帮助。

米曲霉ca-08发酵得到的乳糖酶最适ph范围为4.0-7.0，最适作用温度为80℃，在80℃保温1h后剩余酶活为89％，具有显著的耐热性，可广泛应用于工业生产中，显著地拓展了乳糖酶的工业应用范围，提高了乳糖酶的应用价值。

附图说明

图1：不同ph下的相对酶活；

图2：不同温度下的相对酶活；

图3：80℃下保温后的相对酶活。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1米曲霉ca-08的诱变选育

取两株出发菌株aj2010的新鲜斜面，用10ml0.1％吐温-60洗下新鲜斜面上的孢子，将其转移入盛有玻璃珠的三角瓶，在摇床上振荡打散50min，然后用4层擦镜纸过滤，并进行梯度稀释，于血球计数板计数并调整孢子浓度为6×10⁶个/ml左右，以此作为出发菌悬液。

将装有适量孢子悬液的试管置于一定剂量率的辐照平面上，用co⁶⁰射线进行辐照诱变，照射剂量分别为5万、6万、7万、8万、9万、10万、11万伦琴，处理后进行梯度分离，30℃培养60h。致死率随co⁶⁰射线照射剂量的增加而升高，另外其正突变率随着吸收剂量而增加，综合考虑致死率和正突变率，本试验选择诱变剂量为10万伦琴。每次诱变结束后均将载片置于含990μl无菌生理盐水的ep管中，漩涡震荡1min。稀释涂布后置于30℃培养箱内培养。

初筛培养基(g/l)：乳糖20、蛋白胨1、(nh4)2so41.4、kh2po42、cacl20.3、mgso40.3、toween-802、feso40.5、mnso40.16、znso40.14、cocl20.2、ph5.5。灭菌冷却至60度后加入微滤除菌的1％邻硝基苯酚-β-d-半乳糖苷(onpg)母液，摇匀后加入到灭菌的1.5ml离心管中；

摇瓶复筛培养基(g/l)：麦芽糖50、豆粕20、玉米浆10、kh2po45、(nh4)2so410、ph5.5；

菌株的初筛：

将经过诱变长出的单菌落转接初筛培养基中，30℃培养3d。在超净台中向初筛小管喷洒灭菌的10％na2co3溶液，静置数分钟；挑取颜色变黄的小管按颜色深浅进行降序排列、编号。依次转接保存斜面，30℃培养至孢子成熟，于冰箱4℃保藏。

菌株的复筛：

将初筛菌株转接斜面活化，待孢子成熟后接种复筛培养基，进行摇瓶发酵，每株一瓶、每瓶3环。发酵条件为30℃、120rpm、装液量30ml/250ml，培养3d后测定酶活，选出高产菌株。

通过摇瓶复筛选出5株具有较高酶活的突变株列表如下：

原始菌株与具有较高酶活的突变株的酶活对比

经再次的摇瓶发酵后选育出ca-08为稳定的最高酶活菌株。

实施例2米曲霉ca-08发酵产酶及其所产乳糖酶的提取方法

米曲霉ca-08的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：

斜面培养：挑取一环米曲霉ca-08接种于固体斜面培养基，30℃下恒温培养36h，得一级种子；

摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温30℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；

种子罐培养：将二级种子液按照接种量15％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温30℃，转速200r/min条件下培养45h；

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量6％(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温30℃，转速200r/min，设置通风量：1-2vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液ph值为5.5-5.8，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为105h，得到最终发酵液；发酵液酶活达到103000u/ml；将最终发酵液通过提取与精制方法，获得乳糖酶成品液体酶制剂。

斜面培养基(g/l)：麦汁培养基，8°bé麦汁，琼脂17，ph5.5，121℃灭菌20min；

种子培养基(g/l)：葡萄糖20，蛋白胨5，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁1，其余为水，ph5.5，121℃灭菌20min。

种子罐培养基(g/l)：葡萄糖80，酵母膏5，玉米浆4.5，硫酸铵1，硫酸镁0.8，磷酸二氢钾1.5，氯化钙1，其余为水，ph5.5，121-123℃灭菌30min；

发酵罐培养基(g/l)：麦芽糖100，豆饼粉30，玉米浆27，硫酸镁2.1，硫酸铵5，磷酸二氢钾5，氯化钙1，其余为水，ph5.5，121℃灭菌30min。

补料培养基(g/l)：麦芽糖150，玉米浆25，硫酸镁2，其余为水，121℃灭菌30min。

乳糖酶的提取与精制方法如下：

先将最终发酵液加入1％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

在浓缩液中加入20％(m/v)甘油、0.15％(m/v)山梨酸钾、0.3％(m/v)苯甲酸钠，调节ph5.5，然后进行过滤除菌，即得到乳糖酶成品液体酶制剂。

实施例3米曲霉ca-08发酵性能验证

按照实施例2米曲霉ca-08的发酵产酶方法进行50l发酵罐验证实验，发酵周期105h，其7批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为100762u/ml，下表说明菌株不仅高产乳糖酶而且其发酵性能以及其所产的乳糖酶的酶活均具有显著的稳定性。

表7批次高产乳糖酶菌株的发酵产酶情况

实施例4乳糖酶酶活测定方法

(1)酶液的制备：发酵液6000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

(2)酶活力单位定义：

一个酶活单位(u)即在37℃和ph值5.5条件下每分钟将onpg分解为lμmol黄色的onp所需的酶量。

(3)酶活测定方法：

邻硝基苯酚β-d半乳糖苷(onpg)溶于浓度为0.02mol/l乙酸缓冲液(ph值为5.5)配制成质量分数为0.25％的底物溶液。取400μl酶液加入1600μl底物溶液中，37℃保温15min。加入2ml浓度为1mol/l的na2co3显色，测定420nm光吸收值。计算水解产物邻硝基酚(onp)的含量和酶活性。

实施例5乳糖酶的最适作用ph

以本发明所产的酶活力100000u/ml的乳糖酶为基准，将酶液分别用ph为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的缓冲液稀释，测定酶活力，相对酶活力变化曲线如图1所示，乳糖酶在ph5.5时的酶活力最高，ph适用范围为4.0-7.0。

实施例6乳糖酶的最适作用温度

以酶活力100000u/ml的乳糖酶为基准，在ph值为5.5条件下，分别在不同温度(50、55、60、65、75、80、85)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的最适作用温度为80℃。

实施例7乳糖酶的热稳定性

以酶活力100000u/ml的乳糖酶为基准，在ph值为5.5条件下，80℃下保温，每小时测定剩余酶活力，如图3所示，80℃保温1h后剩余酶活为89.5％，具有良好的耐热保存活性，可广泛应用于高温工业生产中，显著地拓展了乳糖酶的工业应用范围，提高了乳糖酶的应用价值。