本发明属基因工程领域,涉及一种用新的核苷酸序列(lyc8)生产人溶菌酶蛋白的方法,本发明还涉及用上述工艺生产人溶菌酶所需的载体、重组质粒、宿主细胞、获得的人溶菌酶蛋白蛋白产物及该生产方法的应用。
背景技术：
感染性疾病一直是人类健康和生命的主要威胁，目前对于细菌性感染，抗生素及人工合成抗菌药物仍是最主要的治疗手段。然而进入21世纪后，不断出现的多重耐药细菌使感染性疾病的治疗困难重重，如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(mrsa)、万古霉素耐药肠球菌(vre)、青霉素耐药肺炎链球菌(prsp)、泛耐药(pdr)铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等各种超级耐药细菌的出现。因此寻找和开发与传统抗生素结构与作用机制以及作用靶位不同的抗菌药物已是当务之急。
溶菌酶(lysozyme)是一种水解酶，它能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的糖苷键，又称胞壁质酶。该酶作用机理是切断肽聚糖中n-乙酰胞壁酸(nam)与n-乙酰葡萄糖胺(nag)之间的β-1，4-糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。溶菌酶在自然界中分布广泛，按照溶菌酶的不同物种来源，可分为：鸡型(c-型，chickentype)、鹅型(g-型，goosetype)、无脊椎动物型(i-型，invertebratetype)、噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶和细菌溶菌酶。在人体中同时存在鸡型和鹅型，也就是常说的c-型和g-型两种溶菌酶，其中c-型溶菌酶的研究最为广泛，因为它是唯一同时在脊椎动物、无脊椎动物和原索动物中存在的。c-型溶菌酶是大部分脊柱动物(包括哺乳动物)产生的主要溶菌酶，是作为酶结构和功能研究模型的原型溶菌酶。
溶菌酶是一种具有杀菌作用的天然物质，它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀菌能力研究表明：极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。
目前市场上的溶菌酶产品大多以蛋清溶菌酶为主要原料，因为鸡蛋清溶菌酶的提取工艺相对成熟，价格便宜，如上世纪80年代初上市的溶菌酶肠溶片、含片，我国sfda已下达多个个鸡溶菌酶肠溶片生产文号、和含片生产文号。鸡溶菌酶产品在广州、上海、杭州的用量较大。除了应用在医药行业，鸡溶菌酶在日化行业也得到了应用，如口腔护理产品牙膏、漱口液、喷剂，化妆品等。
但是，鸡蛋清溶菌酶对于人体而言是一种异源蛋白，在蛋白质一级结构上与人溶菌酶有较大差异，因此，它具有明显的局限性。鸡溶菌酶用于过敏体质人群时，可引发过敏反应，严重者可导致死亡。另外，鸡溶菌酶在人体内会产生免疫原性与毒副作用，无法用于静脉用药，对于侵入机体内的细菌、病毒无法产生抑制和杀灭作用。由于鸡溶菌酶的局限性，人们开始更加关注人溶菌酶(humanlysozyme，)的研究和开发。人溶菌酶是在人奶汁中发现的抗菌剂之一，且广泛存在于人的体液、细胞和组织器官中，如脾脏，肺脏，肾脏，白细胞，血浆，唾液和眼泪等。我们可以从人奶、胎盘或尿液中少量提取人溶菌酶，但制备材料相当有限，制备成本非常高，因此在医药、日化、食品、饲料添加剂等行业都没得到广泛应用。人溶菌酶与其他来源的溶菌酶相比，有许多无法逾越的优势，人溶菌酶来源于人体，和人体具有天然相容性，不会产生任何副作用和免疫原性。
当前有应用酵母细胞作为工程菌表达人源溶菌酶的研究报道，但一般人源溶菌酶原始dna序列与酵母细胞的氨基酸密码子不相适应，导致表达效率很低，无工业化生产价值。本申请通过大量的理论研究和实验研究发明一个新的dna序列(lyc8)，此段dna序列(lyc8)能在酵母中编码产生人源溶菌酶蛋白，同时利用此段dna序列(lyc8)能在酵母中高效表达人源溶菌酶蛋白。
同时，在人体内，人有多种溶菌酶蛋白，可用基因工程重组表达的方法进行体外表达生产，但不同的表达序列(dna序列和蛋白序列)在不同的真核表达体系，酵母表达体系，昆虫表达体系，cho细胞表达体系中表达量差异巨大，而高效表达是人源溶菌酶生产的关键。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种用dna序列(lyc8)生产人溶菌酶蛋白的方法。
本发明的另一个目的是提供一种新的核苷酸序列,该核苷酸被命名为人lyc8。
本发明的再一个目的是提供一种重组裁体,该裁体含有人lyc8核酸序列并可以通过转化宿主细施,如大肠杆菌、酵母细胞,表达出溶菌酶蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种宿主细胞,该宿主细胞含有人lyc8核苷酸序列的重组质粒并可表达具有人溶菌酶活性的蛋白。
在本发明的一个方面,提供了一种生产具有人溶菌酶活性蛋自的方法,该方法包括:
(1)将分离纯化的编码人溶菌酶蛋白活性多肽的核苷酸序列(lyc8)可操作地连接于表达调控序列,形成人溶菌酶蛋白的表达载体；
(2)将步聚(a)中的表达载体转入宿主细胞,筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞:
(3)高密度培养步(b)中的重组细胞:
本发明中,所述宿主细胞可以为酵母细胞。
本发明中,所使用的核苷酸序列如seqidno1或者seqidno:3所示。
本发明中,具有人溶菌酶活性蛋自的生产方法还包括从高密度培养的重组细胞中分离纯化出具有人溶菌酶活性的蛋白,甚至将其制成冻干粉。
较好的，所述的高密度培养过程中添加甲醇；
当溶解氧气浓度升高到45％时,开始泵入甲醇溶液,速度为2-3ml/升/小时；
当溶解氧气浓度下降到30％后,提高甲醇速度至5-8ml/升/小时；
当将解氧气浓度下降到20％时,提高甲醇速度至l0ml/升/小时。
或者，所述的高密度培养过程中可以添加甘油，以19-25ml/小时/升的速度泵入甘油,时间是5-7小时，直至溶解氧气浓度低于20％时。
另一方面,本发明提供了一种分离出的dna分子,它编码具有人溶菌酶活性的蛋白且其序列为seqidno:l所示。
本发明提供了一种载体,它含有上述dna。
本发明还提供了一种宿主细胞，它含有上述dna或者上述载体。较好的，该细胞为真核细胞。
在本发明中,术语“溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有溶菌酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列,如seqidno.1中核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指,位于seqidno.1序列的编码框核苷酸中,有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性,所以与seqidno.1中核苷酸序列同源性低至约92％的简并序列也能编码出seqidno.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与seqidno.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列,更佳地能在高度严紧条件下与seqidno.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外,该术语还包括与seqidno.1中核苷酸序列的同源性至少92％的核酸序列。
该术语还包括能编码具有与人溶菌酶相同功能的蛋白的seqidno.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若千个(通常为1-90个,较佳地1-60个,更佳地1-20个,最佳地l-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内,较佳地为30个以内,更佳地为l0个以内,最佳地为5个以内)核苷酸。
获得上述溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列,可以通过人工化学合成、从现存的dna库扩增、从含有该序列的细胞、组织、器官中分离纯化得到。
在本发明中,可选用本领域已知的各种载体,如市售的载体。
在本发明中,术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞,昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。在本发明中,“基本纯的”蛋自质或多肽是指其至少占样品总物质的至少80％,最佳地至少90％(按干重或湿重计)a纯度可以用任何合适的方法进行测量,如用柱层析、page或hplc法测量多肽的纯度；基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中,术语“溶菌酶蛋白多肽”指具有溶菌酶蛋白活性的seqidno.4序列的多肽。该多肽的氨基酸序列与seqidno.2中的氨基酸序列相比缺少氨基端19个氨基酸残基,即1-19位的氨基酸。这l9个氨基酸是seqidno2所编码蛋白的分泌肽序列,在蛋白的生物合成过程中被自行切除。该术语还包括具有与人溶菌酶相同功能的seqidno.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为l-50个,较佳地1-30个,更佳地l-20个,最佳地l-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为l0个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氮基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括溶菌酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明还提供了其他多肽,如包含溶菌酶多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了溶菌酶多肽的可溶性片段。通常,该片段具有溶菌酶多肽序列的至少约10个连续氨基酸,通常至少约30个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约l00个连续氨基酸。
本发明还包括溶菌酶多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可与seqidno1中核苷酸序列结合,从而用于抑制细胞内溶菌酶的表达。
本发明还包括一种探针分子,该分子通常具有溶菌酶多肽编码序列的8-100个,较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在lyc8核苷酸分子。
本发明还包括检测lyc8核苷酸序列的方法,它包括用上述的探针与样品进行杂交,然后检测探针是否发生了结合。较佳地,该样品是pcr扩增后的产物,其中pcr扩增引物对应于溶菌酶多肽的编码序列,可位于该编码序列的两側或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
另一方面,本发明还包括对lyc8dna或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于lyc8基因产物或片段。较佳地,指那些能与lyc8基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制溶菌酶蛋白的分子,也包括那些并不影响溶菌酶蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的lyc8基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如fab；或(fab)2片段:抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链fv分子(ladner等人,美国专利no.4,946,778),或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的lyc8基因产物或者其具有抗原性的片段,可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的,表达溶菌酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体包括能阻断溶菌酶功能的抗体以及不影响溶菌酶功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用lyc8基因产物的片段或功能区,通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与lyc8基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞中生产的基因产物来免疫动物而产生,与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽),可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人溶菌酶蛋白属于溶菌酶家族一员。溶菌酶是分解粘多糖的多肽类免疫抗菌分子。它具有耐热、耐酸的理化特性,可溶于水、乙醇、油脂类溶剂,通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀菌能力研究表明:极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。
人源溶菌酶技术可用于眼药水、隐型眼镜冲洗液、鼻腔冲洗液、除臭漱口液、痔疮护理剂、直肠灌洗剂、胃肠道术后康复剂、肿瘤术后辅助治疗剂、沫浴液、护肤化妆品、流质食品添加剂、食品保鲜剂、各种保健食品添加剂、胃药、餐巾纸和防菌湿纸巾等多种产品的改良与升级换代.
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
具体实施方式
在本发明中人lyc8的表达载体是如此获得的:首先,根据seqidno1所述核苷酸序列及表达蛋白所使用的载体ppic9序列,合成如seqidno3所述核苷酸序列；将合成后的序列与pucm19t载体(上海shangon生物工程公司)连接形成lyc8-pucml9重组质粒。分别用限制性内切酶xhoi和ecori酶切lyc8-pucm19质粒和ppic9质粒并分别进行胶回收。随后用t4dna联接酶连接经过处理的目的片段和ppic9质粒。最后将连接产物转化大肠杆菌菌株dh5a,涂布lb-amp平板,酶切鉴定转化子,抽提质粒,测序验证序列的正确性。
培养基的配制：
1.lb培养基：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％(固体加1.5％琼脂粉)，加去离子水定容后，高温高压灭菌。用于培养ppic9/ppic9k原核宿主菌dh5α时，加入amp100μg/ml，4℃保存。
2.ypd培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，加去离子水定容，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至60℃后加入2％的葡萄糖，4℃保存。
3.md平板培养基：酵母氮源培养基(ynb)1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖2％。称取2g琼脂粉定容至80ml，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至60℃后加入10ml10×ynb，2ml500×生物素及10ml10×葡萄糖，铺制平板，4℃保存。
4.mm平板培养基：酵母氮源培养基(ynb)1.34％，生物素4×10-5％，甲醇0.5％。称取2g琼脂粉定容至80ml，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至60℃后加入10ml10×ynb，2ml500×生物素及0.5ml甲醇(分析纯)，铺制平板，4℃保存。
5.ypd-g418平板培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂粉1.5％，g418(设置不同浓度)。100ml去离子水中溶解1g酵母提取物，2g蛋白胨和2g琼脂粉，定容至100ml，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至60℃后加入10ml10×葡萄糖，然后加入100mg/ml的g418，配置终浓度为0.25，0.5，1.0，2.0mg/mlg418的ypd-g418平板。
6.bmgy和bmmy培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，磷酸钾缓冲液(ph6.0)100mmol/l，酵母氮源培养基(ynb)1.34％，生物素4×10-5％，对于bmgy，加入甘油1％，对于bmmy，加入甲醇0.5％。称取10g酵母提取物和5g蛋白胨，溶解于700ml去离子水中，加入100mlph6.0的0.1m磷酸钾缓冲液，对于bmgy，再加入10ml甘油(分析纯)，去离子水定容至900ml，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，使用前加入100ml10×ynb,2ml500×生物素。对于bmmy，使用前加入2.5ml甲醇(分析纯)代替甘油。
酵母gs1l5菌株感受态的制备方法包括如下过程,将酵母gs1l5单克隆菌株接种于lm1ypd培养基,放于摇床上30℃,250转/分钟培养20-30小时。取l00u1培养的上述细胞转接于100m1ypd培养基中,在揺床上30℃,250转/分钟培养l2-18小时,od600＝1.3-1.5.将0d600＝1.3-1.5的细胞培养液平均分至两个50ml离心管,在4℃下,5000转/分钟,离心8分钟。弃上清,加40m14℃无菌去离子水溶解沉淀,之后在4℃下,5000转/分钟,离心8分钟。重复上一步操作一次。弃上清,一管加1m山梨糖醇2ml,另一管加3ml,震荡,将两管合并为一管,离心,4℃下,5000转/分钟,高心8分钟。弃上清,然后用200～500μl预冷的1msorbitol重悬，放冰上备用。
本发明中表达-人溶菌酶的甲醇酵母表达菌株是按如下方法获得的:抽提37℃培养18小时的lyc8-ppic9质粒,然后,用3-6ul限制性内切酶saci切割3-6ug抽提的lyc7-ppic9质粒4-6小时,完全酶切后用与酶切体积相等的氯仿/异戊醇溶液(两者体积之比为24:l)纯化酶切产物,之后用100％乙醇沉淀酶切的质粒,用10-30u1去离子水溶解沉淀并通过核酸电泳测定质粒浓度。制备酵母gs115菌株的感受态,取经限制性内切酶saci切割后回收并定量的lyc8-ppic9质粒5～20ug(溶于5-10u1去离子水中),加入80ul酵母gsll5感受态细胞,转至电转化杯,电击转化。转化参数为；电压1500伏,电阻200欧姆,电容25微法。电击后迅速加入800u1的1m山梨糖醇。从电转杯中将液体吸出，转移到eppendorf管中，30℃静置1小时。然后加入1mlydp培养基，30℃，振荡培养4小时，取适量菌液涂布于md平板。同时转化空质粒ppic9k作为表达的阴性对照。
本发明中mut+和muts转化子筛选的具体步骤为：用无菌牙签挑取md平板上生长的单克隆200～300个，接种至每孔加入150μlypd培养液的96孔中，每个孔一个单克隆。30℃培养24小时后，用枪头将每孔的菌液混匀，并分别取1μl菌液点样于md及mm板上，注意使md/mm板上的克隆编号对应，30℃培养24～48小时，长出白色菌落。在md和mm平板上都生长良好的克隆即mut+表型；在md平板上生长良好但在mm平板上生长很小或不长的克隆为muts表型。
本发明中多拷贝转化子筛选的具体步骤为：重组质粒插入酵母基因组会发生多拷贝插入，一般概率为1～10％，高拷贝插入可能会伴随着高蛋白表达。用灭菌牙签在md帮上挑取mut+表型的克隆200～300个，接种至含g4180.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml的ypd平板，30℃培养72～96小时。
本发明中的“接种”包括一级接种和二级接种。“一级接种”是指将筛选到的高表达酵母菌株接种于ypd培养基,30℃,250转/分揺床培养36小时。本发明中的“二级接种”即将培养36小时的酵母菌转至bmgy培养基(初始发酵体积的5～10％),30℃,250转/分培养至0d600＝2～6,离心,弃上清,用25～50％培养体积的水重新悬浮细胞。
本发明中的“上罐发酵"即将配制好的基本盐培养基(50％发酵罐体积)倒入罐中,通热蒸气121℃灭菌20分钟,冷至29℃,用氨水调ph至4.8-5.8,加入ptm4-5m1/l基本盐培养基。倒入上述的悬浮细胞,在26℃、450转/分、0.3-0.5氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟条件下培养。
本发明中的“饲喂甘油"是指在上述培养24小时后,以19-25ml/小时/升(起始发酵液体积)的速度泵入50％甘油,时间是5-7小时。搅拌速度提高到650转/分。须注意检测发酵液中的溶解氧气浓度,当溶解氧气浓度低于20％时,停止加入甘油。当溶解氧气浓度回升到23％以上时,恢复甘油供给。
本发明中的“饲喂甲醇"是指停止泵入甘油后,当溶解氧气浓度升高到45％时,开始泵入甲醇溶液,速度为2-3ml/升(起始发酵液体积)/小时。当溶解氧气浓度下降到30％后,提高甲醇速度至5-8ml/升(起始发酵液体积)/小时。当将解氧气浓度下降到20％以上时,提高甲醇速度至l0ml/升(起始发酵液体积)/小时。维持此甲醇速度至发酵结束。加入甲醇的时间为2-4天。搅拌速度可提高到800-l500转/分。
本发明中人溶菌酶蛋白分离纯化包括以下步骤:首先,发酵结束后,,4000转/分离心发酵液,收集上清。发酵上清用0.45微米的膜过滤,然后用naoh溶液调ph至8.0。用纯水调积离子强度，随后进行纯化过程。
本发明中的纯化过程包括(1)装柱:以每升发酵液10毫升cm-sephroseff装柱,用0.05mtris-hclph8.0平衡柱子5-8个柱床体积；(2)上样:将发酵液以l0-l00毫升/分钟的流速上柱；(3)清洗:上样结束后,用0.05mtris-hclph8.0洗脱未结合的蛋白,共洗脱4个柱床体积:(4)洗脱:用含有0.20-0.30mnac1的0.05mtris_hclph8.0溶液洗脱；(5)透析:将洗脱液对去离子水4℃透析24小时；(6)冻干:将透析过的洗脱液在冻干机上冻干,得到基本纯的人溶菌酶的白色干粉。
实施例l
将seqidn〇l中所述核苷酸序列与pucml9t载体连接,形成lyc8重组质粒。取2ug,然后用6ul限制性内切酶saci切割3小时,完全酶切后用氯仿/异戊醇将液纯化,之后用l00％乙醇沉淀,用lml去离子水溶解沉淀并通过核酸电泳测定质粒浓度。取经限制性内切酶saci切割后回收并定量的lyc8-ppic9质粒1ug(落于10ul去离子水中),加入80u1酵母gs115感受态细胞,电击转化。取电击液400u1涂md板,30℃培养至克隆长出。用50m1酵母培养基bmmy培养长出的克隆并走sds-page电泳,筛选出表达目的蛋白的克隆；
如本发明所述方法高密度发酵生产人溶菌酶,其中,二级接种时将初始发酵体积的l0％的酵母菌转至bmgy培养基,30℃,250转/分培养至0d600＝6,离心,弃上清,用30％培养体积的水重新悬浮细胞；上罐时,将溶液酸度调至ph＝6后保持不变；加入甘油时,以l8m1/小时/升(起始发酵液体积)的速度泵入；泵入甲醇溶液,速度为2.5m1/升(起始发酵液体积)/小时；
在人溶菌酶纯化过程中,发酵液上样速度为10毫升/分钟。随后按照本发明所述方法分离纯化,得到溶菌酶蛋白。利用本发明新的dna序列(lyc8)能在酵母中高效表达编码产生人源溶菌酶蛋白，若进行高密度发酵，产量为每升发酵液6克人源溶菌酶蛋白(纯度为95％)，远高于应用天然的人源溶菌酶蛋白的dna序列进行重组发酵生产。
实施例2
实施例1所得到的人源性的溶菌酶具有基因产品的一般特点,即纯度高、成本低等。同时由于该蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此,与预计在施用于人时将具有很高的活性和/或很低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)，更重要的是,该产品具有抑制癌细胞粘附作用,可用于癌症病人的肿瘤术后体腔清洗液以减少肿瘤细胞转移的机会。
实施例3
溶菌酶能更好的帮助眼球抵抗外界的感染。溶菌酶大量的存在于人体自然分泌的泪液中,是使眼泪起作用的重要物质。lyc8所得到的人源性的溶菌酶蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此,与预计在施用于人时将具有很高的活性和/或很低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。将实施例l所得到的人源性的溶菌酶蛋白加入眼保健液和各类眼药中,无疑将减轻大量眼病患者及视疲劳患者的痛苦。这不仅能为广大眼病患者解除痛苦,还将带来巨大的经济效益。
实施例4
采用牛津杯法检测lyc-8对测试菌株的抑菌作用，同时用微量肉汤稀释法检测lyc8的mic和mbc。
牛肉膏蛋白胨培养基中加入琼脂，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃左右，用吸管准确吸取15ml培养基加入无菌培养皿中(下层)，待其凝固。另取100μl试验菌株的菌液(菌浓度1.5×105cfu/ml)和10ml该培养基(冷却至50℃左右)充分混匀，加到已凝固的培养基上(上层)，然后用无菌镊子将无菌牛津杯轻轻放入培养皿中，待其凝固。然后在牛津杯中加入待测酶液50μl，37℃培养24h，测量抑菌圈直径，
利用微量肉汤稀释法测定lyc8对多种检测菌株的mic和mbc，无菌操作，将倍比稀释后不同浓度(128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml)的h-lyz溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl；第12孔不加lyc8溶液，作为生长对照。用mh液体培养基稀释待测菌至浓度为0.5麦氏比浊，即1.5×108cfu/ml，经mh肉汤1:1000稀释后，向每孔中加100μl。37℃培养18～24h。实验平行重复三次，
lyc8对所测的多株供试菌的抑菌作用存在差异。金黄色葡萄球菌对lyc8较为敏感，抑菌环直径为14.6mm；微量肉汤稀释法检测lyc8的mic和mbc，对抗藤黄微球菌在极低质量浓度(<32μg/ml)即可对它们产生生长抑制作用。
实施例5
将实施例1中的人源溶菌酶蛋白产物用来免疫动物以产生抗体,具体如下。重组分子用层析法进行分离后各用。也可用sds-page凝胶电泳法进行分离,将电泳条带从凝胶中切下,并用等体积的完全freunds佐剂乳化，用含50-100ug人源溶菌酶蛋白的0.2m1溶液的乳化蛋白,对小鼠进行腹旗内注射，14天后,用非完全freund's佐剂乳化的同样抗原,对小鼠以含50-100ug人源溶菌酶蛋白的0.2m1溶液进行腹膜内注射以加强免疫，每隔14天进行一次加强免疫,至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀lyc8基因翻译产物的能力加以评估。
本发明所涉及的序列如下:
(1)seqidno.l的信息:
(i)序列特征
(a)长度:453bp
(b)类型:核酸
(c)链性:单链
(d)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cdna
(iii)序列推述:seqidno.1
atgaaggcttctgttgttttgtctttgttgggttacttggttgttccatctggtgcttacattttgggtagatgtactgt
tgctaagaagttgcacgatggtggtttggattacttcgaaggttactctttggaaaactgggtttgtttggcttacttcg
aatctaagttcaacccaatggctatttacgaaaacactagagaaggttacactggtttcggtttgttccaaatgagaggt
tctgattggtgtggtgatcacggtagaaacagatgtcacatgtcttgttctgctttgttgaacccaaacttggaaaagac
tattaagtgtgctaagactattgttaagggtaaggaaggtatgggtgcttggccaacttggtctagatactgtcaatact
ctgatactttggctagatggttggatggttgtaagttg
(2)seqidno.2的信息:
(i)序列特征
(a)长度:146个氨基酸
(b)类型氨基酸
(d)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:多肽
(iii)序列描述:seqidno.2
mkasvvlsllgylvvpsgayilgrctvakklhdggldyfegyslenwvclayfeskfnpmaiyentregytgfglfqmrgsdwcgdhgrnrchmscsallnpnlektikcaktivkgkegmgawptwsrycqysdtlarwldgckl
(3)seqidno.3的信息
(i)序列特征
(a)长度:381碱基
(b)类型:核酸
(c)链性:单链
(d)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(iii)序列描述:seqidno.3
tacattttgggtagatgtactgttgctaagaagttgcacgatggtggtttggattacttcgaaggttactctttggaaaa
ctgggtttgtttggcttacttcgaatctaagttcaacccaatggctatttacgaaaacactagagaaggttacactggtt
tcggtttgttccaaatgagaggttctgattggtgtggtgatcacggtagaaacagatgtcacatgtcttgttctgctttg
ttgaacccaaacttggaaaagactattaagtgtgctaagactattgttaagggtaaggaaggtatgggtgcttggccaac
ttggtctagatactgtcaatactctgatactttggctagatggttggatggttgtaagttg
(4)seqidno.4的信息:
(i)序列特征
(a)长度:127个氨基酸
(b)类型:氨基酸
(c)链性:单链
(d)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:多肽
(iii)序列描述:seqidno.4
yilgrctvakklhdggldyfegyslenwvclayfeskfnpmaiyentregytgfglfqmrgsdwcgdhgrnrchmscsallnpnlektikcaktivkgkegmgawptwsrycqysdtlarwldgckl。
sequencelisting
<110>上海复华兴生物技术有限公司
<120>一种人源溶菌酶蛋白lyc8及其生产工艺和应用
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atgaaggcttctgttgttttgtctttgttgggttacttggttgttccatctggtgcttac60
attttgggtagatgtactgttgctaagaagttgcacgatggtggtttggattacttcgaa120
ggttactctttggaaaactgggtttgtttggcttacttcgaatctaagttcaacccaatg180
gctatttacgaaaacactagagaaggttacactggtttcggtttgttccaaatgagaggt240
tctgattggtgtggtgatcacggtagaaacagatgtcacatgtcttgttctgctttgttg300
aacccaaacttggaaaagactattaagtgtgctaagactattgttaagggtaaggaaggt360
atgggtgcttggccaacttggtctagatactgtcaatactctgatactttggctagatgg420
ttggatggttgtaagttg438
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seralaleuleuasnproasnleuglulysthrilelyscysalalys
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