烟粉虱C型溶菌酶Btlys-c基因及所编码蛋白的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学和基因工程【技术领域】，旨在提供一种烟粉虱C型溶菌酶Btlys-c基因及所编码蛋白的制备与应用。该烟粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)基因及其编码的核苷酸序列，使其能够应用在大肠杆菌中表达新的蛋白、编码序列。所述抗菌活性的重组蛋白纯化后进行抑菌实验的结果表明：重组的烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)基因原核表达的重组蛋白具有抗革兰氏阳性菌的能力。进一步的，利用本发明的方法通过现有基因工程方法生产，在开发抗菌类药物、食品保鲜剂和饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。
【专利说明】烟粉虱C型溶菌酶Btlys-C基因及所编码蛋白的制备与应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程【技术领域】。本发明涉及一种烟粉虱溶菌酶 (Lysozyme)基因及其所编码蛋白的应用，尤其涉及一种烟粉風溶菌酶（Lysozyme)的体外 重组表达技术、活性重组蛋白的分离纯化以及对微生物抗菌作用研究。
【背景技术】
[0002] 溶菌酶（Lysozyme)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶 解酶。由Flemming于1922年发现的，它广泛存在于真核生物和原核生物中，能切断肽 聚糖中的N-已酰葡萄糖胺和N-已酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，引起细胞裂解。根据 溶菌酶的一级结构、分子量和生物来源，可以将溶菌酶分为6种类型，S卩：噬菌体Τ4溶菌 酶（phage-type)、植物溶菌酶（plant-type)、微生物溶菌酶（bacteria-type)和3种动物 型溶菌酶，即溶菌酶 C型（chicken-lysozyme type)、I 型（invertebrate-type)和 G型 (goose-type)。其中，G型溶菌酶主要存在于脊椎动物中，I型溶菌酶只存在于无脊椎动物 中，而C型溶菌酶则是唯一同时存在于脊椎动物和无脊椎动物中的类型，也是目前研究得 最广泛、最透彻的类型。溶菌酶作为一种天然安全的食品防腐剂，受到许多国家和组织的青 睐。早在二十世纪七十年代，欧洲国家已开始将溶菌酶用于保存婴儿食品。溶菌酶加入乳 中具有类似于凝乳酶的作用，可以降解酪蛋白，使牛乳人乳化。此外，溶菌酶也可用于花生 酱、面条、面包、蛋糕等食品的防腐。
[0003] 烟粉風Bemisia tabaci (Gennadius)已成为一种世界性的入侵性灾害性昆虫，在 世界各地暴发成灾，造成惨重的损失。该虫不仅大量取食植物汁液，导致植物枯萎，而且传 播多种植物病毒，是重要的病毒传播媒介，常导致植物病毒病大流行，使作物严重减产或绝 收。溶菌酶在传毒媒介昆虫烟粉虱中的研究，有利于更好的揭示其在免疫反应以及传播植 物病毒中的作用及其工作机制，同时也为开发和筛选抗菌药物提供依据。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种烟粉虱C型溶菌 酶Btlys-C基因及所编码蛋白的制备与应用。
[0005] 为解决技术问题，本发明的解决方案是：
[0006] 提供一种烟粉虱C型溶菌酶Btlys-C基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0007] 本发明进一步提供了所述烟粉虱c型溶菌酶Btlys-C基因编码的蛋白，其氨基酸 序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本发明进一步提供了利用前述烟粉虱c型溶菌酶Btlys-C基因制备具有抗菌活性 的重组蛋白的方法，是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗 菌活性的重组蛋白。
[0009] 本发明进一步提供了前述蛋白在制备抗菌类制剂、免疫增强剂或饲料添加剂中的 应用。
[0010] 本发明的有益效果在于：
[0011] 本发明所提供的烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因及其编码的核苷酸序列，使其 能够应用在大肠杆菌中表达新的蛋白、编码序列。所述抗菌活性的重组蛋白纯化后进行抑 菌实验的结果表明：重组的烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)基因原核表达的重组蛋白具有抗 革兰氏阳性菌的能力。进一步的，利用本发明的方法通过现有基因工程方法生产，在开发抗 菌类药物、食品保鲜剂和饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为基于ML法构建的不同生物C型溶菌酶系统进化树。
[0013] 图2为IPTG诱导的pET28a-Btlysc-BL21和纯化的重组烟粉虱C型溶菌酶 (Btlys-c)蛋白的 SDS-PAGE凝胶电泳图。1 :未诱导pET28a-Btlysc-BL21 菌株；Lane 2 :lmM IPTG诱导的pET28a-Btlysc-BL21菌株；3 :纯化重组蛋白；M :蛋白Marker。
[0014] 图3为烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)重组蛋白对枯草芽孢杆菌的抗菌作用图。
[0015] 图4为烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)重组蛋白对大肠杆菌的抗菌作用图。 具体实施方案
[0016] 本发明的烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 由该烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0018] 本发明所述烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)基因 cDNA的克隆方法是以烟粉虱总RNA 反转录得到cDNA为模板，构建cDNA文库，根据烟粉虱转录组筛选得到Btlys-c EST序列， 然后经RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基 因 cDNA全长序列。
[0019] 本发明用于表达烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)重组蛋白的成熟肽基因序列是以烟 粉虱肽C型溶菌酶（Btlys-c)全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到，它来源于 烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)全长基因区域所对应的基因片段。
[0020] 本发明上述含有烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)基因的大肠杆菌基因表达载体优先 由本发明合成的C型溶菌酶（Btlys-c)基因与大肠杆菌表达载体pET-28a构建的重组表达 载体,命名为pET28a-Btlysc。
[0021] 本发明能表达烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)基因的大肠杆菌重组菌株优先由含有 烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)的表达载体pET28a-Btly SC转化大肠杆菌BL21(DE3)而得到 的菌株，命名为 pET28a-Btlysc-BL21。
[0022] 上述烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)的重组蛋白具体制备方法是通过如下技术方案 来实现：选取大肠杆菌重组菌株pET28a-Btlysc-BL21接种在IOml含有卡那霉素的LB液体 培养基，37°C培养过夜，取50 μ 1菌液加入到装有50ml Kana+LB液体培养基的150ml无菌 三角瓶中，37°C，150rpm的摇箱中培养6?8h至对数期，加入IOOmM IPTG至终浓度为ImM， 27°C，250rpm振荡培养。当重组菌生长进入平台期后收集菌体，经分离纯化得到重组烟粉虱 C型溶菌酶（Btlys-C)蛋白。
[0023] 本发明所述烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因在制备具有活性的重组蛋白中应 用。其中，所述应用的方法是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达，经蛋白 纯化及对重组蛋白进行透析复性，获得具有抗菌活性的重组蛋白。例如：将获得的烟粉虱C 型溶菌酶（Btlys-c)基因克隆到pET-28a(Novagen公司）表达载体，转化到大肠杆菌BL21 细胞。进行诱导表达，获得具有活性的重组蛋白（即烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因编 码的活性蛋白）。
[0024] 以下结合实施方案对本发明作进一步详细描述。
[0025] 实施案例1 :烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因全长cDNA克隆
[0026] L 1、TRIzol 法提取总 RNA
[0027] (1)将一定量（200只烟粉虱）冰冻lmin，放入I. 5ml离心管中，加入Iml TRIzol 试剂，充分研磨勻楽，室温静置5min。
[0028] (2)向离心管中加入0. 2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置 2min〇
[0029] (3) 4°C，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新I. 5ml的离心管中。
[0030] (4)向离心管中加入0. 5ml异丙醇，将管中液体轻轻混勻，室温静置lOmin。
[0031] (5) 4°C，12000g 离心 IOmin,弃掉上清液。
[0032] (6)向离心管中加入Iml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4°C，7500g离心5min，弃掉上 清液。（此时加入无水乙醇，可于_80°C超低温冰箱中长期保存）
[0033] (7)晾干离心管，加入适量的DEPC H2O溶解（65°C促溶），分光光度计测量0D260/ 0D280的值，比值在1. 8?2. O之间时，进行下一步实验。
[0034] L 2、cDNA 第一链合成
[0035] (1)往0· 5ml无菌的离心管中分别加入1 μ 1提取的RNA，1 μ I SMART IV /5' PCR 正向引物，1μ I CDS 111/3'PCR反向引物，力口 2μ I DEPC H2O使总体积达到5μ 1。
[0036] (2)混匀离心管中的试剂并短暂离心，72°C孵育2min。
[0037] (3)迅速将离心管冰浴2min，短暂离心。
[0038] (4)往离心管中分别加入 2 μ I 5XFrist_strand Buffer，1 μ I 20mM 二硫苏糖醇 φΤΤ)，1μ1 IOmM (ΙΝΤΡ,ΙμΙ Reverse Transcriptase 反转录酶，反复吹打混勻，短暂离 心。
[0039] (5) 42-C 孵育 Ih。
[0040] (6)将离心管置于冰上2?3min，终止反应。取一部分用于进一步实验，其余 于-80°C超低温冰箱冷冻保存。
[0041] 1.3、dsDNA 合成
[0042] (1)往0. 5离心管中分别加入1 μ 1第一链合成反应产物，5 μ I IOXLA 811打61'(]\^2+打66)，5 4 1]\^2+，8 4 1(1抑13，14 15]\^1?1'1￥/5'？0?正向引物， 14 10^111/3'？0?反向引物，0.54 11^了&8〇嫩聚合酶，29.5以1(1(1!120，充分混匀，短暂 离心。
[0043] (2)?〇?仪中按以下扩增程序（95°〇，208;25?28父（951：，58 ;681：，61^11))扩增。
[0044] (3)取5μ1 PCR产物用于凝胶检测（检测条带所含分子量范围及条带亮暗），取 检测结果良好的1 μ 1产物稀释100倍用于做以后PCR的模板，其余于-80°c超低温冰箱冷 冻保存。
[0045] 1. 4、PCR扩增烟烟粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因 cDNA 5'和3'末端
[0046] 操作按 Clontech 公司试剂盒 SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit 说明书进 行。根据试剂盒的要求，依据已知的C型溶菌酶（Btlys-c)基因 EST序列分别设计两条上、 下游引物，以进行巢式PCR。所用引物分别为：
[0047]
【权利要求】
1. 一种烟粉虱C型溶菌酶Btlys-C基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述烟粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸 序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 利用权利要求1所述烟粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因制备具有抗菌活性的重组蛋白 的方法，其特征在于，是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗 菌活性的重组蛋白。
4. 权利要求2所述蛋白在制备抗菌类制剂、免疫增强剂或饲料添加剂中的应用。
【文档编号】A61K38/47GK104498515SQ201410735009
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月7日 优先权日:2014年12月7日
【发明者】陈学新, 王知知, 时敏 申请人:浙江大学