本发明属于基因工程和发酵工程领域，一种重组人溶菌酶工业化发酵方法，具体涉及一种高密度发酵重组人溶菌酶的生产工艺方法。
背景技术：
溶菌酶(1ysozyme)是1923年由青霉素的发明者--英国著名科学家弗莱明在偶然机会中发现的一种天然抗菌物质，又称胞壁质酶(muramidase)或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶(n-acetylmuramideglycanohydrlase)，它属于碱性酶，能极大地水解致病菌中黏多糖。溶菌酶可水解肽聚糖中n.乙酰胞壁酸和n.乙酰葡萄糖胺之间的b2.1，4糖苷键，在渗透压作用下导致革兰氏阳性菌细胞壁破裂，从而发生重要的溶菌作用。它主要通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，这种溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用。
毕赤酵母作为一类单细胞真核生物，有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达调控机制。作为一种微生物，具有生长繁殖迅速、营养要求简单和便于工业化大规模发酵培养的优点。用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易通过离心将含目的蛋白质的上清与酵母细胞加以分离，大大简化了目的蛋白的纯化过程。
毕赤酵母表达体系的显著特点是菌株表达量很容易从摇瓶水平按比例放大到高密度的发酵罐培养基中。在进行小量表达时，常用摇瓶培养，由于培养液的酸碱度、培养物的通气不足、碳源最适添加量以及甲醇浓度等影响酵母表达的关键因素均无法控制，大大影响了外源蛋白的表达水平。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供一种操作简便、成本低廉、产品纯度高的重组人溶菌酶发酵方法，尤其涉及一种重组人溶菌酶工业化发酵方法，以达到工艺周期短、收率高，易于线性放大至生产规模的目的。
本发明反复测试并优化了高细胞密度发酵的工艺研究，如用自动控制发酵罐进行高密度发酵培养，通过不断摸索、筛选，确定重组酵母高密度发酵的最佳条件，可以使外源蛋白在发酵罐中的表达水平比普通摇瓶提高10～100倍，完全可以满足大规模生产的需要。
本发明提供了一种重组人溶菌酶工业化发酵方法，该重组人溶菌酶发酵方法为将表达人溶菌酶的种子发酵液加入发酵罐进行高密度发酵；
所述的高密度发酵包括甲醇诱导和甘油补料；
当甘油彻底耗尽，开始甲醇诱导。
所述的发酵罐高密度发酵采用bsm发酵培养基。
所述的高密度发酵的温度控制在25-30℃。
所述的重组人溶菌酶发酵方法中，高密度发酵时，将含重组人源溶菌酶的发酵液的ph为5.5-7.5。
所述的甘油补料，是指当发酵罐中的甘油耗尽后缓慢而连续的加入甘油溶液。
所述的甘油补料方式包括连续补料、恒速流加、指数流加或者反馈补料-恒溶氧流加。
本发明中，重组人溶菌酶的高密度发酵阶段，诱导温度在28～32℃。
本发明中，人重组人溶菌酶的高密度发酵阶段，诱导时间在72～96小时。
本发明中，补加甘油的量为50％。
本发明中，甘油补料彻底耗尽后饥饿20-60分钟；
然后，连续加入甲醇溶液进行甲醇诱导。
上述方案中bsm发酵培养基的配方可参考：磷酸氢二钾24.7g，caso40.8g，k2so416.2g，mgso4.7h2o15.9g，ptm14ml，泡敌1ml；加水至1l定容；
其中ptm1溶液的配方为：cuso4.5h2o5g，ki0.07g，mnso4.h2o3.3g，na2moo4.2h2o0.24g，h3bo30.02g，znso4.7h2o18g，feso4.7h2o60g，cocl2.6h2o0.92g，biotin0.2g，加水至1l定容；
甲醇连续滴加补料的速率可以由甲醇浓度检测仪控制。
具体的，本发明的方法其包括：
(1)毕赤酵母中重组人溶菌酶的高密度发酵工艺方法；
(2)将工作种子接种于bsm培养基中，培养温度为28-30℃，并进行搅拌；
(3)加氨水或磷酸控制发酵体系的ph值为5.8-6.5；
(4)通过调节搅拌转速和通气量以维持do；
(5)当发酵罐中的甘油耗尽后缓慢而连续的加入甘油溶液，待甘油再次彻底耗尽后(do迅速上升)，饥饿半小时；
(6)连续加入含ptm1的甲醇溶液进行甲醇诱导，控制溶氧、搅拌速度、温度、ph连续发酵培养；
(7)诱导后72-96小时后结束发酵；
(8)放罐，发酵液通过碟式离心机来达到固液分离的目的，收集离心后的上清液；
(9)用层析的方法从上清液中提取纯化重组人溶菌酶蛋白；
(10)所述的重组毕赤酵母的高密度发酵工艺中最佳的工艺条件为：甘油溶液的补料方式包括周期补料、恒速流加、指数流加或者反馈补料-恒溶氧流加；
(11)所述的毕赤酵母的高密度发酵工艺方法中，其工作种子采用如下措施制备：先挑取1个重组单克隆菌落到一级种子ypd培养基中培养菌体浓度od600达到6.0，得到一级种子培养液；再将上述培养液倒入含有体积比为50％的bsm发酵罐培养基的ypd二级；种子培养基中培养菌体浓度od600达到40.0，即得发酵工作种子液。
本发明提供了一种操作简便、成本低廉、产品纯度高的重组人溶菌酶发酵方法。通过不断摸索、筛选，反复测试并优化了高细胞密度发酵的工艺，本发明可以使溶菌酶蛋白在发酵罐中的表达水平比普通摇瓶提高10～100倍，完全可以满足大规模生产的需要。
本发明的优点包括：
1、温度控制，最大限度的促进酵母菌增长并抑制杂菌生长；
2、甘油分次加入，维持菌量持续增长；
3、在菌体维持饥饿状态，甘油彻底耗尽，开始甲醇诱导；
4、甲醇的补加根据菌体生长情况，采取逐渐增加的方式，更好的促进毕赤酵母的生长。
具体实施方式
实施例1工作种子培养
从划线的ypd平板上挑取1个单克隆菌落到一级种子ypd培养基(500ml三角瓶装50mlypd，121℃高压灭菌20min)中培养24小时左右；
菌体浓度od600达到6.0以上，得到一级种子培养液；
再将上述培养液倒入含有体积比为50％发酵罐培养基(bsm)的ypd二级种子培养基中培养18-20小时左右至菌体浓度od600达到40.0以上，即得发酵工作种子液。
实施例2接种前准备
发酵罐冲洗干净，用ph6.86和ph4.0标准液校正发酵罐的ph计探头，然后将己配制好的发酵罐培养基(bsm)倒入发酵罐中，121℃高压灭菌30min，高压过程中校正溶解氧do为0％，冷却后接好其他附属设备。
实施例3接种
灭菌结束待冷却到25-28℃后，在火焰圈的保护下加入消泡剂和ptm1然后以5％的接种量将发酵工作种子液接种于30l自动控制发酵罐中，培养基装量为15l；培养温度为30℃，搅拌转速为200-250rpm/min，自动流加氨水控制ph值为5.0-5.5，调节好发酵设备的转速、空气流量、罐压；
通气量为2vvm，生长阶段温度为30℃，设置溶氧(do)-转速联动，转速可根据do的变化而变化。通过调节搅拌转速和通气量以维持do在20-30％左右。
实施例4生长阶段补加甘油
由于菌体在二级种子培养阶段已经初步适应了发酵罐培养基，在发酵过程中菌体经过相对较短的适应期后进入对数生长期，此时ph值自动控制，自动流加氨水将ph值控制在5.0-5.5，调节转速和通气量使do维持在20-50％；
当发酵罐中的甘油耗尽后，可观察到do值上升，表明甘油已经耗尽；
此时开始流加50％甘油溶液；当菌体达到一定浓度后，停止补料。
实施例5甲醇诱导表达重组蛋白阶段
停止补加甘油后，菌体维持饥饿状态半小时，待甘油彻底耗尽，开始甲醇诱导。开始以变速流加的方式限制性的流加补料诱导培养基，诱导h-lyz表达；
诱导阶段温度为26-28℃，ph5.5-6.0。诱导培养基的补料速率根据do和our来控制。发酵过程由发酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集；
诱导后72-96小时结束发酵；
放罐，发酵液通过碟式离心机来达到固液分离的目的，收集离心后的上清液；
可以采用层析的方法从上清液中提取纯化重组人溶菌酶蛋白；
经过高密度发酵，产量可达到每升发酵液5.8克人源溶菌酶蛋白(纯度为95％)，明显高于常规发酵生产的产量。
实施例6溶菌酶活力测试
利用微量肉汤稀释法测定，上述实施例获得的重组人溶菌酶蛋白对所测的多株供试菌均有抑菌作用，例如，对表皮葡萄球菌较为敏感，抑菌环直径为8.2mm；对多杀性巴氏杆菌的抑菌直径为25.9mm。此外，对抗藤黄微球菌也具有生长抑制作用。
实施例7用微球菌法测定溶菌酶活力
检测样品：人溶菌酶发酵液；
标准的溶菌酶活力检测方法的效价测定方法如下：
(1)供试品溶液的制备
取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g，加水溶解1000ml,调节ph值至6.2]适量使溶解,并稀释成每1ml中含溶菌酶50μg的溶液。
(2)底物悬浮液的制备
称取溶壁微球菌15～20mg，加磷酸盐缓冲液(ph6.2)0.5～1ml,在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(ph6.2)适量，使总体积约为50ml，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。
(3)测定法
精密量取25±0.1℃的底物悬浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数a<[0]>，然后精密量取25±0.1℃的供试品溶液0.15ml(相当于溶菌酶7.5μg)，加到上述比色池中，迅速混匀，用秒表计时,至60秒时再测定吸收度a；同时精密量取磷酸盐缓冲液(ph6.2)0.15ml，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数a'<[0]>及60秒的读数a'。
(4)效价单位定义
在室温25℃、ph值6.2时，在波长450nm处，每分钟引起吸收度下降0.001
为一个酶活力单位。按下式计算：(a<[0]>－a)－(a'<[0]>－a')
效价单位数(u/mg)＝───────────────10<6>w
式中w为测定液中供试品的重量，μg。
实施例8
初筛及杀菌曲线，
初筛用牛津杯法，确定不同溶度的溶菌酶溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小；
溶菌酶分子量大，扩散法渗透扩散速度慢，抑菌圈小边缘不清晰，故本实验进一步降低上层琼脂含量到1％，以利扩散，同时开展液相反应法探索；
方法1：14cm双碟，每碟10个钢管，每管0.2ml。下层lb琼脂2.2％，上层lb琼脂1.0％。采用tris-hcl空白缓冲液及氨苄0.01％作阴性阳性对照。测试用菌用大肠杆菌及金葡菌，lb培养液摇瓶，按0.2ml/200ml及0.02ml/200ml两种浓度测试。
方法2：5ml离心管作反应器，2ml菌液+2ml溶菌酶液，37度反应过夜后，测活计数。检测菌液用大肠杆菌及金葡菌，lb培养摇瓶液，0.1ml+100mltris-hcl稀释。测活计数，lb平板上加各0.2ml(或10倍稀释液0.2ml)反应液，涂布后37度孵育过夜计数。
实验结果显示，人溶酶对金葡菌有高度杀菌活性，对大肠杆菌反应迟钝。