一种固态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法与流程

本发明涉及铁皮石斛内生真菌多糖的固态发酵综合开发应用领域，特别涉及一种固态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法。

背景技术：

铁皮石斛多糖由于其结构表征和显著的性质而引起了越来越多的关注。铁皮石斛多糖的广谱生物学特性包括体外和体内免疫调节、改善肺功能、通便活性、抗肿瘤、抗氧化、抗诱变活性等。此外，已有大量已发表的研究证明来自铁皮石斛的多糖有益于维持健康和预防疾病，包括胃溃疡，心血管疾病，糖尿病，肺病和严重的癌症等。

然而，由于过度开发和栖息地破坏，铁皮石斛于1987年被列入中国植物红皮书。因此，除了通过人工栽培获取铁皮石斛之外，有必要寻找一种获得相同或相似的生物活性多糖的替代方法。近来，虽然多糖主要来自于植物提取，但多糖也是内生真菌产生的次级代谢产物。由于成本效益和环境优势，微生物发酵过程被认为是生物活性化合物的有效技术。与植物提取法相比，微生物发酵具有几个显着的优点，例如菌种的快速生长，易于培养和下游加工，成本效益和环境友好特性等。因此，微生物发酵获取多糖受到了越来越多的关注。此外，液体深层发酵(smf)和固态发酵(ssf)是用于开发微生物的两种培养系统。已有许多研究表明ssf在几个方面优于smf，因为它具有许多优点，包括更高的生产率，更低的水和能量需求，易于通气，更低的无菌需求，相似的微生物自然栖息地，更容易下游加工，利用更便宜的木质纤维素材料作为固体基质，环境友好等。各种木质纤维素材料(主要是农业或工业残留物，如大米，麦麸，米糠，玉米糠等)在ssf下可作为良好的基质。关于选择ssf的合适底物的研究主要集中在工农业残留物上，因为它们对丝状真菌具有潜在的优势，这些真菌能够渗透到这些固体基质中最坚硬的基质中，这有助于在菌丝体尖端存在膨胀压力。此外，这些农业工业废物的利用一方面提供了替代基质，另一方面有助于解决污染问题，否则可能导致其进一步污染。

与smf相比，ssf可以获得更高的产量或更好的产品特性。此外，ssf的底物成本也要低得多，并且实现了对废物的有效利用和进一步增值。大多数研究都集中在来自smf的生物活性多糖，很少有关于内生真菌fusariumsolanido7在ssf中的产生生物活性多糖的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于寻求一种更加绿色环保、低廉的发酵方式获取铁皮石斛内生真菌多糖，并且得到的多糖栖生物活性不弱于来源于液体发酵的多糖，因此提供了一种固态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种固态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法，包括以下步骤：

(1)将活化的铁皮石斛内生真菌种子液接种于已灭菌的固态培养基中发酵培养；所述固态培养基为含有木质纤维素的培养基；

(2)待发酵完成后，收获菌丝体，提取纯化多糖。

优选的，步骤(1)所述铁皮石斛内生真菌为fusariumsolanido7，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno:m2017145，保藏日期为2017年3月27日，专利申请号为201710512714.4。

优选的，步骤(1)所述活化是在马铃薯葡萄糖水培养基(pdb培养基)中25-28℃活化培养5-7d。

优选的，步骤(1)所述固态培养基中水分含量为50-55wt％。

优选的，步骤(1)所述木质纤维素由米糠、豆渣、玉米麸和大米组成，各成分配比如下：大米75-80.0wt％、豆渣5.0-10wt％、米糠5-10.0wt％、玉米麸5.0-10wt％。

进一步优选的，所述木质纤维素由以下组分组成：大米80.0wt％、豆渣5.0wt％、米糠10.0wt％、玉米麸5.0wt％。

优选的，步骤(1)中，用1mhcl调整固态培养基的ph为6.5。

优选的，步骤(1)所述灭菌是在121℃下高温灭菌20-25min。

优选的，步骤(1)所述铁皮石斛内生真菌种子液的接种量为15-20vol％。

进一步优选的，所述铁皮石斛内生真菌种子液的接种量为15vol％。

优选的，步骤(1)所述发酵培养的条件为25-28℃培养30-35天。

进一步优选的，所述发酵培养的条件为28℃培养30天。

优选的，步骤(2)中，提取纯化多糖是将收获的菌丝干燥、研磨、浸提，合并滤液后离心，再将上清液浓缩、醇沉、离心，收集沉淀复溶后透析，透析液浓缩后即得固态发酵粗多糖；然后采用ab-8大孔吸附树脂脱除所得固态发酵粗多糖的蛋白和色素，再采用deae-52纤维素树脂和sephadexg-200葡聚糖凝胶进一步纯化，得多糖。

进一步优选的，所述干燥是50℃真空干燥。

进一步优选的，所述浸提是90℃热水浴浸提4h，收集菌丝体，重复上述热水浴浸提(90℃、4h)操作2次。

进一步优选的，所述离心是5000rpm离心10min。

进一步优选的，所述浓缩是减压蒸馏浓缩，温度为60℃；醇沉时乙醇与浓缩液体积比为4：1；所述离心的条件为10000rpm下离心10min；所述透析所用透析袋的截留分子量为3500da，透析的时间为72h。

进一步优选的，采用ab-8大孔吸附树脂脱出蛋白和色素的洗脱液为蒸馏水，由于ab-8对蛋白和色素的吸附大于多糖，所以蒸馏水洗脱的组分为多糖组分，对收集的洗脱组分减压浓缩，收集洗脱液于紫外可见分光光度计进行扫描，确认蛋白和色素已被去除；对脱除蛋白和色素的组分进一步采用deae-52纤维素阴离子交换树脂进行纯化，洗脱液分别为0、0.2、0.4、0.6m的nacl溶液，苯酚硫酸法检测洗脱液中多糖浓度，根据苯酚硫酸法测定的吸光度变化绘制洗脱曲线，得到不同多糖组分，合并相同组分的收集管浓缩后，蒸馏水透析(截留分子量3500da)48h，去除nacl,减压浓缩，得到不同的纯化组分dgs1-a和dgs2-a；采用sephadexg-200对所得到dgs1-a和dgs2-a进一步纯化，确定其是否为单一多糖组分，洗脱液为蒸馏水，苯酚硫酸法跟踪监测所收集的组分。更优选的，nacl溶液的浓度0、0.2、0.4、0.6mol/l。

以上所得铁皮石斛内生真菌多糖效果测定的方法，包括以下步骤：

(1)将活化的fusariumsolanido7菌株接种于已灭菌的固态培养基中，室温培养，收获菌丝体，提取纯化多糖，收集纯化多糖组分dgs1和dgs2；

(2)取对数生长期的raw264.7细胞，调整密度为2×10⁵/ml，加到96孔板，37℃、5％co2贴壁培养24h后，吸取培养液，分别加入纯化的多糖组分dgs1、dgs2(62.5、125、250、500、1000μg/ml)、20ng/ml的脂多糖lps，每个样本设置3个平行组，封口膜封好板后置于37℃、含5％co2恒温培养箱孵育24h，收集上清液；

(3)根据grisee试剂盒说明取已收集的上清液100ul于96孔板，加入等体积的grisee试剂混合，室温下震荡反应10min后在540nm波长处测定吸光度，根据no2-标准曲线计算上清液中no释放量；

根据elisa试剂盒说明测定已收集上清液的细胞因子(tnf-α、il-6)的释放量。

进一步地，步骤(2)中在对raw264.7细胞加药之前，首先通过mtt(四甲基偶氮唑蓝)比色法进行细胞毒性试验，检查内生真菌多糖组分的细胞毒性，即对raw264.7细胞的生长抑制作用。

进一步地，选用小鼠巨噬细胞raw264.7评价所获取多糖组分的免疫活性，对已培养之最佳状态的raw264.7细胞分别添加20ng/ml的脂多糖lps，62.5、125、250、500、1000μg/ml的dgs1和dgs2于37℃培养箱培养24h后，按照肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)elisa试剂盒描述测定多糖组分对raw264.7细胞的细胞因子释放的影响；按照griessno试剂盒测定多糖组分对lps细胞诱导的raw264.7细胞no释放的影响。结果表明：dgs1、dgs2可明显促进raw264.7细胞tnf-α、il-6、no的分泌和释放，亦表明dgs1和dgs2具有免疫增强作用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明采用固体培养基进行多糖发酵，其中麸皮、米糠等物质适合丝状真菌的生长繁殖，并且固体培养基多为生物质中的木质纤维素成分，产物产量、活性均有提高，制备过程更加绿色、环保，为微生物发酵获取多糖提供一种新的方式。

(2)本发明方法工艺简单易行，条件温和，节能减排，设备要求低，为实现微生物多糖的有效综合开发应用提供了新途径。

附图说明

图1为纯化后的多糖组分的uv全波长扫描图。

图2a为多糖经deae-52纤维素阴离子交换树脂纯化的吸光度曲线图。

图2b、图2c为多糖经sephadexg-200葡聚糖凝胶纯化的吸光度曲线图。

图3a为纯化的多糖组分mtt细胞毒性试验的效果图。

图3b为纯化的多糖组分对raw264.7细胞的增殖活性影响效果图。

图3c、图3d为纯化的多糖组分对raw264.7细胞因子影响效果图。

图3e为纯化的多糖组分对no含量的影响效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的描述，但本发明并不局限于此。

实施例1

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7菌株在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养7d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置固体发酵培养基(大米80.0wt％、豆渣5.0wt％、米糠10.0wt％、玉米麸5.0wt％，以上百分含量基于木质纤维素)，调整水分含量为55wt％，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，室温发酵30天；待发酵完成后，收集菌丝，真空干燥并研磨，然后90℃热水浸提4h，过滤收集菌体，重复热水提取2次，合并提取液，减压浓缩，4℃醇沉12h、5000rpm离心10min、流水透析72h、减压浓缩、冷冻干燥，得到粗多糖样品，产量为2.77±0.15g/ml；

(3)将得到的粗多糖样品用蒸馏水溶解为2mg/ml的溶液，采用ab-8大孔吸附树脂脱除蛋白和色素，蒸馏水洗脱，收集洗脱液，全波长扫面检测蛋白和色素脱出效果(见图1)，然后减压浓缩得脱蛋白色素的粗多糖；然后采用deae-52纤维素阴离子交换树脂纯化粗多糖，洗脱液为浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8的nacl溶液，自动收集器收集不同浓度的洗脱液，苯酚硫酸法检测洗脱液多糖浓度，绘制洗脱曲线，得到多糖组分dgs1和dgs2(见图2a)；对得到的组分采用sephadexg-200进一步纯化，确定deae-52纯化的组分为单一组分(见图2b、图2c)。

(4)取已传代培养2～3代的小鼠单核巨噬细胞raw264.7通过mtt比色法测定多糖纯化组分dgs1、dgs2对其生长抑制作用，结果表明所得多糖组分对raw264.7几乎无抑制作用，即无明显的细胞毒性(见图3a、图3b)，可进行后续实验研究；然后评价所得纯化组分对raw264.7细胞的增殖活性及免疫活性的影响，结果表明不同浓度的多糖组分均能促进raw264.7细胞的增殖；并且均能不同程度激活raw264.7细胞分泌细胞因子tnf-α、il-6(见图3c、图3d、图3e)，表明dgs1和dgs2具有较高的增强机体免疫的作用。

实施例2

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7菌株在ph6.5的pdb培养基中25℃活化培养7d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置固体发酵培养基(大米80.0wt％、豆渣5.0wt％、米糠10.0wt％、玉米麸5.0wt％)，调整水分含量为55wt％，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，室温发酵30天；待发酵完成后，收集菌丝，真空干燥并研磨，然后90℃热水浸提4h，过滤收集菌体，重复热水提取2次，合并提取液，减压浓缩，4℃醇沉12h、5000rpm离心10min、流水透析72h、减压浓缩、冷冻干燥，得到粗多糖样品，产量为1.97±0.26g/ml。

实施例3

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7菌株在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养5d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置固体发酵培养基(大米80.0wt％、豆渣5.0wt％、米糠10.0wt％、玉米麸5.0wt％)，调整水分含量为55wt％，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，室温发酵30天；待发酵完成后，收集菌丝，真空干燥并研磨，然后90℃热水浸提4h，过滤收集菌体，重复热水提取2次，合并提取液，减压浓缩，4℃醇沉12h、5000rpm离心10min、流水透析72h、减压浓缩、冷冻干燥，得到粗多糖样品，产量2.32±0.17g/ml。

实施例4

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7菌株在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养7d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置固体发酵培养基(大米80.0wt％、豆渣5.0wt％、米糠10.0wt％、玉米麸5.0wt％)，调整水分含量为50wt％，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，室温发酵30天；待发酵完成后，收集菌丝，真空干燥并研磨，然后90℃热水浸提4h，过滤收集菌体，重复热水提取2次，合并提取液，减压浓缩，4℃醇沉12h、5000rpm离心10min、流水透析72h、减压浓缩、冷冻干燥，得到粗多糖样品，产量为2.41±0.12g/ml。

实施例5

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7菌株在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养7d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置固体发酵培养基(大米80.0wt％、豆渣10.0wt％、米糠5.0wt％、玉米麸5.0wt％)，调整水分含量为55wt％，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，室温发酵30天；待发酵完成后，收集菌丝，真空干燥并研磨，然后90℃热水浸提4h，过滤收集菌体，重复热水提取2次，合并提取液，减压浓缩，4℃醇沉12h、5000rpm离心10min、流水透析72h、减压浓缩、冷冻干燥，得到粗多糖样品，产量2.39±0.17g/ml。

实施例6

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7菌株在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养7d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置固体发酵培养基(大米80.0wt％、豆渣5.0wt％、米糠10.0wt％、玉米麸5.0wt％)，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种20％(v/v)的种子液，室温发酵30天；待发酵完成后，收集菌丝，真空干燥并研磨，然后90℃热水浸提4h，过滤收集菌体，重复热水提取2次，合并提取液，减压浓缩，4℃醇沉12h、5000rpm离心10min、流水透析72h、减压浓缩、冷冻干燥，得到粗多糖样品，产量为2.63±0.13g/ml。

实施例7

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7菌株在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养7d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置固体发酵培养基(大米80.0wt％、豆渣5.0wt％、米糠10.0wt％、玉米麸5.0wt％)，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种20％(v/v)的种子液，室温发酵35天；待发酵完成后，收集菌丝，真空干燥并研磨，然后90℃热水浸提4h，过滤收集菌体，重复热水提取2次，合并提取液，减压浓缩，4℃醇沉12h、5000rpm离心10min、流水透析72h、减压浓缩、冷冻干燥，得到粗多糖样品，产量为2.52±0.15g/ml。