本发明涉及生物基因领域，更具体的说，是一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：宫颈癌是常见的妇科肿瘤之一,我国每年新发病例占全世界的1/4,卫生部已将宫颈癌筛査列入社区医院常规体检项目。目前常采取的细胞学检测有其固有的缺陷：①检出率低，仅凭光镜形态难以对hpv感染进行准确判断；②操作复杂，对检测人员要求高；③通量低，一次一人，难实现社区医院普及。who和iarc联合推荐人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,hpv）检测用于宫颈癌筛查。hpv属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的1、环状双链dna病毒，基因组长约8000碱基对（bp），分为3个功能区，即早期转录区（e区）、晚期转录区（l区）和非转录区（长控制区，lcr）。hpv通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。对于感染生殖道和肛门的hpv，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道hpv感染具有普遍性，据统计70%～80%的女性在其一生中会有至少一次的hpv感染，但大多数感染为自限性，超过90％的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。而持续性的高危型hpv感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7%的宫颈癌患者体内检测到高危型hpvdna的存在，其中hpv16型、18型、45型和31型感染占80%。低危型hpv一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。关于高危型与低危型的划分，国际上许多机构都给出了参考建议，依据who国际癌症研究机构（iarc）及其他国际组织的研究成果，将hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。多年来，国际上通用的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的诊断主要遵循“三阶梯式”诊断程序，即宫颈细胞学、阴道镜及组织病理学检查。宫颈细胞学检查是普遍应用的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的筛查方法，可发现早期病变。但宫颈细胞学检查存在其固有的局限性。高危型hpv检测用于宫颈细胞学检查异常患者的分流及宫颈癌筛查，可有效地增加宫颈病变检出率，提高细胞学检查敏感性，并降低筛查频率。hpv核酸检测及基因分型试剂是以特定高危型hpv核酸（包括dna和rna）序列为检测目的，对人宫颈样本(如人宫颈脱落上皮细胞或分泌物等)进行体外定性检测的试剂，以确定受试样本中是否存在高于阳性判断值水平的高危型hpv病毒，或同时鉴定感染hpv的基因型别。现有hpv核酸检测技术主要包括杂交捕获法、酶切信号放大法、pcr-荧光探针法、基因芯片法、pcr-杂交法等。1.杂交捕获法杂交捕获试验是利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大。首先dna双链释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链，dna单链与rna组合探针结合为rna-dna杂合体，特异性抗体将rna-dna杂合体捕获，偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与rna-dna杂合体结合，碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强度可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定rna-dna杂合体的含量。能检测13种高危型hpv，包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。2.酶切信号放大法酶切信号放大法，以cervista高危hpv检测系统为代表，能检测14种高危hpv，它是基于cleavase酶促反应的原理，通过两步反应，即识别目标dna及产生可检测的荧光信号，最终进行荧光阅读得到结果。3.基因芯片法基因芯片法是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量dna探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后与标记的样本杂交,通过对杂交信号的检测分析,得出样本的遗传信息(基因序列和表达信息)。目前国内的基因芯片法hpv检测试剂都是采用pcr体外扩增和dna反向点杂交相结合的dna芯片技术。4.pcr-荧光探针法选用特异性病毒的保守基因片段设计特异引物及特异taqman探针，探针能与引物扩增区域中间的对应的一段dna模板发生特异性结合，在pcr反应过程中，taq酶的外切酶活性将荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对相应病毒核酸的自动化检测。该项技术具有灵敏度高、特异性强；定量准确、定量范围宽；可实现一次反应检测多个样本等特点。技术实现要素：为了弥补以上不足，本发明提供了一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒及其制备方法。本发明的方案是：一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，所述试剂盒包括hpv68、52、56、58型dna引物探针混合液、hpv39、51、59、66型dna引物探针混合液、hpv16、45、35型dna引物探针混合液、18、33、31、ic型dna引物探针混合液、扩增反应液、阴性对照品与阳性对照品。作为优选的技术方案，所述hpv68、52、56、58型dna引物探针混合液的四对引用探针分别为hpv68型特异性探针seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3；hpv52型特异性探针seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6；hpv56型特异性探针seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9；hpv58形特异性探针seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12，针对的目的片段为hpv病毒非l1区域；hpv68型特异性探针的引物序列如下5'-ggccaattgtgaaggtaccg-3'如seqidno.1；5'-cttctacaaaaaaccatccgttacac-3'如seqidno.2；其探针序列如下5'-tggggacgggacgg-3'如seqidno.3。hpv52型特异性探针的引物序列如下5'-aaacggtcagaccgaaacc-3'如seqidno.4；5'-cagcacctcacacaattcgt-3'如seqidno.5；其探针序列如下5'-aacacagtgtagctaacgcacggccatgt-3'如seqidno.6。hpv56型特异性探针的引物序列如下5'-tgcattgtgacagaaaaagacgat-3'如seqidno.7；5'-ctccagcaccccaaacatg-3'如seqidno.8；其探针序列如下5'-tcatctaatagcacatggttggaccggg-3'如seqidno.9。hpv58型特异性探针的引物序列如下5'-ggcatgtggatttaaacaaaaggt-3'如seqidno.10；5'-tctcatggcgttgttacaggttac-3'如seqidno.11；其探针序列如下5'-cactgcacagcgccctgtccaa-3'如seqidno.12。作为优选的技术方案，所述hpv39、51、59、66型dna引物探针混合液的四对引用探针分别为hpv39型特异性探针seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15；hpv51型特异性探针seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18；hvp59型特异性探针seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21；hvp66形特异性探针seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24；hpv51型特异性探针seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18针对的目的片对为hpv病毒l1基因区域；其中hpv39型特异性探针seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15，seqidno.18；hvp59型特异性探针seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21，hvp66形特异性探针seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24针对的目的片段为hpv病毒非l1区域；hpv39型特异性探针的引物序列如下5'-gcaggaagctatacaggacagtgtc-3'如seqidno.13；5'-cttgggtttctcttcgtgttagtct-3'如seqidno.14；其探针序列如下5'-cccgttttgtggtccagcaccg-3'如seqidno.15。hpv51型特异性探针的引物序列如下5'-cagactaatwacattaggacatcc-3'如seqidno.16；5'-caaacttgttaggatctggtaactg-3'如seqidno.17；其探针序列如下5'-tacctaaaacctcaacgcgtgctgct-3'如seqidno.18。hpv59型特异性探针的引物序列如下5'-tgtatggagaaacattagaggctgaa-3'如seqidno.19；5'-tggacatagaggttttaggcatctataa-3'如seqidno.20；其探针序列如下5'-agacaccgttacatgagctgctgatacgc-3'如seqidno.21。hpv66型特异性探针的引物序列如下5'-ctgtgaacataaaagacgatttcattat-3'如seqidno.22；5'-ttggtactttaccatgcatggttata-3'如seqidno.23；其探针序列如下5'-atgcatggaccgggtcatgtttgcag-3'如seqidno.24。作为优选的技术方案，所述hpv16、45、35型dna引物探针混合液的三对引用探针分别为hpv16型特异性探针seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27；hpv45型特异性探针seqidno.28、seqidno.29、seqidno.30；hpv35型特异性探针seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33，针对的目的片段为hpv病毒非l1区域；hpv16型特异性探针的引物序列如下5'-agctcagaggaggaggatgaa-3'如seqidno.25；5'-ggttacaatattgtaatgggctc-3'如seqidno.26；其探针序列如下5'-ccagctggacaagcagaaccgg-3'如seqidno.27。hpv45型特异性探针的引物序列如下5'-cagtgtaatacatgttgtgaccag-3'如seqidno.28；5'-acaggatctaattcattctgaggt-3'如seqidno.29；其探针序列如下5'-caagaaagacttcgcagacgtagggaaacac-3'如seqidno.30。hpv35型特异性探针的引物序列如下5'-aaaaaccgctgtgtccagttg-3'如seqidno.31；5'-cacctcggtttctctacgtgttg-3'如seqidno.32；其探针序列如下5'-attccataacatcggtggacggt-3'如seqidno.33。作为优选的技术方案，所述18、33、31、ic型dna引物探针混合液的四对引用探针分别为hpv18型特异性探针seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36；hpv33型特异性探针seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39；hpv31型特异性探针seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42；hpvic型特异性探针seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45；所述hpvic型特异性探针seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45针对的目的片段为β-globin基因，hpv18型特异性探针seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36；hpv33型特异性探针seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39；hpv31型特异性探针seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42针对目的片段为hpv病毒非l1区域；hpv18型特异性探针的引物序列如下5'-agaggccagtgccattcgt-3'如seqidno.34；5'-gtttctctgcgtcgttggagt-3'如seqidno.35；其探针序列如下5'-tcctgtcgtgctcggttgcagc-3'如seqidno.36。hpv33型特异性探针的引物序列如下5'-gcatgatttgtgccaagcat-3'如seqidno.37；5'-ctcagatcgttgcaaaggttt-3'如seqidno.38；其探针序列如下5'-actatacataacattgaactacagtgcgtggaatgc-3'如seqidno.39。hpv31型特异性探针的引物序列如下5'-acgattccacaacataggagga-3'如seqidno.40；5'-tacacttgggtttcagtacgaggt-3'如seqidno.41；其探针序列如下5'-ctccaacatgctatgcaacgtcc-3'如seqidno.42。hpvic型特异性探针的引物序列如下5'-tgcatttgactcctgaggagaa-3'如seqidno.43；5'-gggcctcaccaccaacttc-3'如seqidno.44；其探针序列如下5'-agggcagtaacggcag-3'如seqidno.45。作为优选的技术方案，所述扩增反应液包括taq酶、buffer、dntps及纯化水。作为优选的技术方案，所述taq酶为热启动taq酶。作为优选的技术方案，所述dntps是四种核苷酸a、t、g、c的混合物。本发明还提供一种制备所述的人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒的方法，包括以下步骤：1）扩增反应液制备将taq酶、buffer、dntps及纯化水在生产环境应为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%；进行配制装管，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存；2）hpv68、52、56、58型dna引物探针混合液制备在生产环境为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%；取hpv68型特异性探针seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3；hpv52型特异性探针seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6；hpv56型特异性探针seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9；hpv58形特异性探针seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12四对引物探针冻干粉，加纯化水将其配成浓度为10μm的溶液，配制装管，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存；3）hpv39、51、59、66型dna引物探针混合液制备在生产环境为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%；取hpv39型特异性探针seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15；hpv51型特异性探针seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18；hvp59型特异性探针seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21；hvp66形特异性探针seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24；四对引物探针冻干粉，加化水将其配成浓度为10μm的溶液，配置装管，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存；4）hpv16、45、35型dna引物探针混合液制备在生产环境为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%；hpv16型特异性探针seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27；hpv45型特异性探针seqidno.28、seqidno.29、seqidno.30；hpv35型特异性探针seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33，三对引物探针冻干粉，加纯化水将其配成浓度为10μm的溶液，配制装管，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存；5）18、33、31、ic型dna引物探针混合液制备在生产环境为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%。取hpv18型特异性探针seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36；hpv33型特异性探针seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39；hpv31型特异性探针seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42；hpvic型特异性探针seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45四对引物探针冻干粉，加纯化水将其配成浓度为10μm的溶液，配制装管，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存；6）阳性对照品的制备在生产环境为万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%；取质粒hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、ic用灭菌纯化水稀释后装管，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存；将步骤1至步骤6的制成的试剂管与阴性对照品试剂管装盒，-20℃暂存保存。本发明有益效果：扩增的特异性，pcr扩增效率好；检测灵敏度高，结果稳定可靠；尽可能的避免了假阳性和假阴性的结果；简化了操作步骤，检测的类型更多。本发明是基于pcr-荧光探针法原理，多靶序列，更加快速、准确的判断hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、ic型核酸有无并进行分型鉴定。具体实施方式实施案例本发明主要涉及pcr(聚合酶链式反应)，pcr包括三个基本步骤，即：模板dna的变性、模板dna与引物的退火复性、引物的延伸。pcr反应体系包括5种基本成分，依次为：dna聚合酶、dntps、mg2+、引物、模板dna。扩增反应液，包含taq酶、buffer、dntps及纯化水，其生产环境应为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%。取taq酶、buffer、dntp及纯化水按照表1的配方进行配制，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存。表1扩增反应液配方组分浓度配制量/人份taq酶5u/μl0.1μlbuffer(mg2+plus)20mm2.5dntps2.5mm2h2o/12.9采用的taq酶为热启动taq酶，其在72℃之前不发挥活性，能够避免在升温过程中（或配置反应体系）发生链的错配，从而保证扩增的特异性。采用的dntps是四种核苷酸a、t、g、c的混合物,主要作用在于pcr在第三步延伸的过程中,需要这几种核苷酸,以碱基互补原则,在酶的作用下与需要扩增的模板链进行连接,从而达到复制模板链的目的。采用的buffer(mg2+plus)能够提供聚合酶链式反应（pcr）所需的环境，含有的mg2+对taq酶有激活作用，在核苷酸进入聚合酶的活性中心时，能够消除dna骨架上磷酸基团的负电荷，从而促进dna的合成。一般来说，提高mg2+浓度会增加pcr扩增的效率，但是，mg2+加多了之后，容易造成taq酶扩增的特异性降低，所以控制好mg2+浓度对pcr来说很关键。pcr中taq酶的量与buffer(mg2+plus)、dntps息息相关，本发明通过正交实验优化了taq酶、mg2+、dntps的含量，按表3的配方，pcr扩增效率最佳。hpv68、52、56、58型dna引物探针混合液，四对引物探针，用于扩增hpv68、52、56、58型dna。其生产环境为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%。取四对引物探针冻干粉，按其标识的含量用纯化水将其配成浓度为10μm的溶液。按照表2配方进行配制，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存。表2hpv68、52、56、58型dna引物探针混合液配方组分浓度配制量/人份seqidno.110μm0.25μlseqidno.210μm0.25μlseqidno.310μm0.10μlseqidno.410μm0.25μlseqidno.510μm0.25μlseqidno.610μm0.10μlseqidno.710μm0.25μlseqidno.810μm0.25μlseqidno.910μm0.10μlseqidno.1010μm0.25μlseqidno.1110μm0.25μlseqidno.1210μm0.10μlh2o/1.10μl本发明的hpv39、51、59、66型dna引物探针混合液，四对引物探针，用于扩增hpv39、51、59、66型dna。其生产环境为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%。取四对引物探针冻干粉，按其标识的含量用纯化水将其配成浓度为10μm的溶液。按照表3配方进行配制，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存。表3hpv39、51、59、66型dna引物探针混合液配方组分浓度配制量/人份seqidno.1310μm0.25μlseqidno.1410μm0.25μlseqidno.1510μm0.10μlseqidno.1610μm0.25μlseqidno.1710μm0.25μlseqidno.1810μm0.10μlseqidno.1910μm0.25μlseqidno.2010μm0.25μlseqidno.2110μm0.10μlseqidno.2210μm0.25μlseqidno.2310μm0.25μlseqidno.2410μm0.10μlh2o/1.10μl本发明的hpv16、45、35型dna引物探针混合液，三对引物探针，用于扩增hpv16、45、35型dna。其生产环境为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%。取三对引物探针冻干粉，按其标识的含量用纯化水将其配成浓度为10μm的溶液。按照表4配方进行配制，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存。表4hpv16、45、35型dna引物探针混合液配方组分浓度配制量/人份seqidno.2510μm0.25μlseqidno.2610μm0.25μlseqidno.2710μm0.10μlseqidno.2810μm0.25μlseqidno.2910μm0.25μlseqidno.3010μm0.10μlseqidno.3110μm0.25μlseqidno.3210μm0.25μlseqidno.3310μm0.10μlh2o/1.70μl本发明的hpv18、33、31、ic型dna引物探针混合液，四对引物探针，用于扩增18、33、31、ic型dna。其生产环境为十万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%。取四对引物探针冻干粉，按其标识的含量用纯化水将其配成浓度为10μm的溶液。按照表5配方进行配制，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存。表5hpv18、33、31、ic型dna引物探针混合液配方组分浓度配制量/人份seqidno.3410μm0.25μlseqidno.3510μm0.25μlseqidno.3610μm0.10μlseqidno.3710μm0.25μlseqidno.3810μm0.25μlseqidno.3910μm0.10μlseqidno.4010μm0.25μlseqidno.4110μm0.25μlseqidno.4210μm0.10μlseqidno.4310μm0.25μlseqidno.4410μm0.25μlseqidno.4510μm0.10μlh2o/1.10μl本发明的阳性对照品，其特征在于包含14种hpv高危型目的基因片段，用于试剂盒质控。其生产环境为万级洁净区，温度18-28℃，湿度45-65%。取质粒hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、ic用灭菌纯化水稀释到表6配方，贴上标签，写上名称、批号、配制人和有效期，-20℃暂存。表6阳性对照品配方制成的试剂管与阴性对照品试剂管装盒，装盒后产品基本组成成分及装量见表7。表7产品组成成分及装量为了更好地理解本发明，下面结合使用操作进一步阐明本发明的内容。本发明试剂盒主要在pcr实验室使用，需要在试剂准备区、标本制备区、扩增产物及分析区进行操作。1.试剂配制(试剂准备区)1.1试剂盒组分室温解冻，充分融化后，上下颠倒混匀，震荡混匀数秒，弹除气泡，7000rpm离心数秒备用。1.2根据待测样本数（n），计算需配制的反应数（n+2）。1.2.1hpv68、52、56、58型反应液配制：取扩增反应液17.5μl*（n+2），hpv68、52、56、58型dna引物探针混合液3.5μl*（n+2），加入到1.5ml离心管，震荡混匀数秒，弹除气泡，7000rpm离心数秒，按照21μl/份分装至一新的荧光pcr专用八联管或pcr管中，待用。1.2.2hpv39、51、59、66型反应液配制：取扩增反应液17.5μl*（n+2），hpv39、51、59、66型dna引物探针混合液3.5μl*（n+2），加入到1.5ml离心管，震荡混匀数秒，弹除气泡，7000rpm离心数秒，按照21μl/份分装至一新的荧光pcr专用八联管或pcr管中，待用。1.2.3hpv16、45、35型反应液配制：取扩增反应液17.5μl*（n+2），hpv16、45、35型dna引物探针混合液3.5μl*（n+2），加入到1.5ml离心管，震荡混匀数秒，弹除气泡，7000rpm离心数秒，按照21μl/份分装至一新的荧光pcr专用八联管或pcr管中，待用。1.2.4hpv18、33、31、ic型dna反应液配制：每份操作如下：取扩增反应液17.5μl*（n+2），hpv18、33、31、ic型dna引物探针混合液3.5μl*（n+2），加入到1.5ml离心管，震荡混匀数秒，弹除气泡，7000rpm离心数秒，按照21μl/份分装至一新的荧光pcr专用八联管或pcr管中，待用。（备注：样本数（n+2）=n个样本+1个阳性对照品+1个阴性对照品）注：配制后的反应液应当天使用。2.样本处理（标本制备区）核酸提取试剂由裂解液、结合液、清洗液ⅰ、清洗液ⅱ、清洗液ⅲ、纳米磁珠、洗脱液组成。将待测样本与阴性对照品按以下步骤进行处理：2.1取样本100μl到1.5ml离心管，加入400μl裂解液，吹打混匀，70℃加热10min；2.2向上述离心管中依次加入300μl结合液，20μl磁珠，吹打混匀，常温下静置5min，用磁铁吸附纳米磁珠30s，弃上清；2.3将离心管放入离心机，高速短时离心，用磁铁吸附纳米磁珠，以去掉管壁上液体；2.4向离心管中加入200μl清洗液ⅰ，用移液枪吹打混匀纳米磁珠，用磁铁吸附纳米磁珠30s，弃上清；2.5向离心管中加入200μl清洗液ⅱ，用移液枪吹打混匀纳米磁珠，用磁铁吸附纳米磁珠30s，弃上清；2.6向离心管中加入200μl清洗液ⅲ，用移液枪吹打混匀纳米磁珠，用磁铁吸附纳米磁珠30s，弃上清；2.7将离心管放入离心机，高速短时离心，用磁铁吸附纳米磁珠，尽量弃掉残夜；2.8向离心管中加入50μl洗脱液，用移液枪吹打混匀纳米磁珠，70℃加热5min；2.9用磁铁吸附纳米磁珠，将含dna的上清液转移至无rna酶污染的离心管中待用。3.加样（标本制备区）每反应总体积（25μl）=反应液（21μl）+模板（4μl）取步骤2提取纯化的样本4μl，以及4μl阳性对照品，加入到步骤1.2.1、步骤1.2.2、步骤1.2.3、步骤1.2.4中准备好的管中，盖好管盖，震荡混匀数秒，弹除气泡，7000rpm离心数秒备用。4.pcr扩增（扩增产物及分析区）将步骤4种准备好的反应管置于荧光定量pcr仪上，记录样本孔位，设置反应体积为25μl，控温方式为模块控温，按照表8设置pcr反应参数设置完成后，保存程序并运行。表8pcr反应参数5.读数基线设置选取6-12个循环。阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点，推荐手动设为0.16。基线及阈值线设置完后后，读取各样本的ct值。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。序列表<110>湖北德立森科技有限公司<120>一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒及其制备方法<141>2018-10-12<160>45<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggccaattgtgaaggtaccg20<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cttctacaaaaaaccatccgttacac26<210>3<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tggggacgggacgg14<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaacggtcagaccgaaacc19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cagcacctcacacaattcgt20<210>6<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aacacagtgtagctaacgcacggccatgt29<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tgcattgtgacagaaaaagacgat24<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ctccagcaccccaaacatg19<210>9<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tcatctaatagcacatggttggaccggg28<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ggcatgtggatttaaacaaaaggt24<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tctcatggcgttgttacaggttac24<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cactgcacagcgccctgtccaa22<210>13<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gcaggaagctatacaggacagtgtc25<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14cttgggtttctcttcgtgttagtct25<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cccgttttgtggtccagcaccg22<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16cagactaatacattaggacatcc23<210>17<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17caaacttgttaggatctggtaactg25<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tacctaaaacctcaacgcgtgctgct26<210>19<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19tgtatggagaaacattagaggctgaa26<210>20<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20tggacatagaggttttaggcatctataa28<210>21<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21agacaccgttacatgagctgctgatacgc29<210>22<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22ctgtgaacataaaagacgatttcattat28<210>23<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23ttggtactttaccatgcatggttata26<210>24<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24atgcatggaccgggtcatgtttgcag26<210>25<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25agctcagaggaggaggatgaa21<210>26<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26ggttacaatattgtaatgggctc23<210>27<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27ccagctggacaagcagaaccgg22<210>28<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28cagtgtaatacatgttgtgaccag24<210>29<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29acaggatctaattcattctgaggt24<210>30<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30caagaaagacttcgcagacgtagggaaacac31<210>31<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31aaaaaccgctgtgtccagttg21<210>32<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32cacctcggtttctctacgtgttg23<210>33<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33attccataacatcggtggacggt23<210>34<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34agaggccagtgccattcgt19<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gtttctctgcgtcgttggag20<210>36<211>22<212>dna<213>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