一类电子供体-受体-供体荧光分子及其制备方法和应用与流程

本发明属于有机小分子荧光探针领域，涉及一类d-a-d(电子供体-受体-供体)近红外荧光分子、其制备方法，以及在生物样品成像分析中的应用。

背景技术：

荧光分子的发展与应用在最近的十多年中飞速进步，已经陆续在化学传感、光电器件、生物检测以及疾病的早期诊断等领域获得了丰硕的成果。随着越来越多功能性愈加强大的荧光成像仪器的诞生，如荧光共聚焦显微镜、铟镓砷光电二极管成像仪等，使得荧光分子用于各类细胞、组织、生物体的成像结果在探究生命科学奥秘的过程中具有更强的说服力和生物意义。

由于短波长荧光分子用于生物组织成像深度、分辨率等方面的局限性，并且容易因为自身荧光造成假阳性，荧光分子的一大主要发展方向就是向发射波长更长而努力，使其能够在近红外窗口，甚至近红外一区(700–1000nm)、近红外二区(1000–1700nm)具有荧光发射。而目前有机小分子荧光分子实现波长红移的方法除了在传统荧光分子骨架中引入硅、硒等原子(如硅基罗丹明类染料)，最为广泛应用的就是扩大刚性结构，延长π电子体系，因此，需要人们探究出多种反应条件温和、操作简便的合成方法来具有良好发光特性的化合物。

技术实现要素：

基于分子内电荷转移(ict)荧光发射机理的电子供体-受体-供体(d-a-d)结构型化合物具有背景荧光发射低等特点，本发明的目的是提供一类电子供体-受体-供体荧光分子及制备方法和应用，以一类邻苯二胺类的电子供体-受体-供体的化合物为原料，加入邻二羰基化合物与之反应成环，将化合物刚性结构进一步扩大，成功设计出一类电子受体分子骨架为喹喔啉的近红外荧光分子。

本发明提供的一类电子供体-受体-供体荧光分子，特点是所述荧光分子具有如下通式i或ii：

通式i中：

x为o、s或se；

r为h、c1-c8烷基、烷基链取代的糖、不同链长取代或非取代聚乙二醇基；

r¹和r²各自独立为：h、c1-c8烷基、取代或非取代芳环或芳杂环；

通式ii中：

r³和r⁴各自独立为h、c1-c8烷基、酯基、不同链长取代或非取代聚乙二醇基；r³和r⁴连接成环；r³和r⁴与氮原子所连苯环形成并五元环或并六元环；

r⁵和r⁶各自独立为h、c1-c8烷基、取代或非取代芳环或芳杂环。

一种上述一类电子供体-受体-供体荧光分子的制备方法，该方法包括以下具体步骤：

2.1、通式i的制备方法：

摩尔比为1:1–100的通式i类化合物与邻二羰基化合物反应，邻二羰基化合物作为酰化剂，溶剂为甲醇与二氯甲烷的混合溶剂，室温反应1-8小时，得到通式i类化合物；

2.2、通式ii的制备方法：

摩尔比为1:1–100的通式ii类化合物与邻二羰基化合物反应，邻二羰基化合物作为酰化剂，溶剂为甲醇与二氯甲烷的混合溶剂，室温反应1-8小时，得到通式ii类化合物。

一种上述一类电子供体-受体-供体荧光分子在生物样品成像分析中的应用。

上述的应用，所述的生物样品包括但不限于细胞。

本发明针对有机荧光分子普遍存在的光漂白现象，在荧光分子骨架的平面刚性结构两端引入柔性基团，使得光漂白现象得到一定的缓解。而两端供电子体的变化对荧光分子的荧光性质起决定性作用，利用此性质对两端供电子体进行特定的结构修饰即可实现可调的荧光性质。另外，本发明所述荧光分子具有近红外荧光发射，且光稳定性好，有良好的生物兼容性，在生物体内代谢速度快，是一类极具应用前景的有机荧光分子。

附图说明

图1为本发明s1荧光分子的紫外吸收和荧光发射谱图；

图2为本发明s1荧光分子用于shsy5y神经细胞成像的光稳定性实验示意图。

具体实施方式

本发明的目的之一是提供通式为i的d-a-d近红外荧光分子：

其中，x为o、s或se。r为h、c1-c8烷基；不同链长取代或非取代聚乙二醇基；烷基链取代的糖(如葡萄糖、吡喃糖、乳糖、半乳糖等)；r¹和r²各自独立为h、c1-c8烷基、取代或非取代芳环或芳杂环。

优选地，x为s；r为r¹为甲基、r²为h，或者r¹为h、r²为甲基。

本发明的目的之二是提供通式ii的d-a-d近红外荧光分子：

其中，x为o、s或se。r³和r⁴各自独立为：h、c1-c8烷基、酯基、不同链长取代或非取代聚乙二醇基；r³和r⁴连接成环；r³或r⁴与氮原子所连苯环形成并五元环或并六元环；r⁵和r⁶各自独立为h、c1-c8烷基、取代或非取代芳环或芳杂环。

优选地，x为s；r³或r⁴为甲基、乙基或连接成环与氮原子形成吡咯烷基；r³或r⁴与氮原子所连苯环形成并六元环，即r⁵为甲基、r⁶为h，或者r⁵为h、r⁶为甲基。

本发明的部分优选的d-a-d近红外荧光分子如下所示，这些实施例只针对本发明做进一步说明，并不对本发明的范围构成任何限制。

本发明的目的之三是提供本发明d-a-d近红外荧光分子的制备方法：

3.1、通式i的制备方法：

摩尔比为1:1–1:100的通式i类化合物与邻二羰基化合物反应，邻二羰基化合物作为酰化剂，溶剂为甲醇与二氯甲烷的混合溶剂，室温反应1-8小时，得到通式i类化合物；

在另一优选例中，r为

在另一优选例中，所用邻二羰基化合物为丙酮醛(40％水溶液)。

在另一优选例中，所述反应时间为4小时。

3.2、通式ii的制备方法：

摩尔比为1:1–1:100的通式ii类化合物与邻二羰基化合物反应，邻二羰基化合物作为酰化剂，溶剂为甲醇与二氯甲烷的混合溶剂，室温反应1-8小时，得到通式ii类化合物。

在另一优选例中，r³和r⁴均为甲基。

在另一优选例中，所用邻二羰基化合物为丙酮醛(40％水溶液)。

在另一优选例中，所述反应时间为4小时。

本发明的目的之四是提供本发明d-a-d近红外荧光分子对生物样品成像分析中的应用

4.1、d-a-d近红外荧光分子的紫外吸收和荧光发射测量

将i或ii荧光分子溶于dmac中制成1mm/ml母液，置于4℃冰箱保存。测量时稀释，最终溶剂条件为40％dmac，60％ph＝7.410mmpbs，分别测吸收和荧光发射光谱。

4.2、d-a-d近红外荧光分子在神经细胞内的光稳定性测量

将5μl浓度为10μm的i或ii荧光分子的1％dmso溶液加入到shsy5y细胞内，37℃、5％co2条件下孵育1h，用pbs洗三次。在pbs中，激发光源持续照射，对其进行共聚焦成像(激发波长488nm，收集波长600-900nm)。

实施例1

化合物s1的合成

化合物1(15.0mg,0.027mmol)溶解在1.0ml混合溶剂(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1v/v)中，0.3mlmgo水溶液(40％)，室温搅拌4h。tlc检测反应完毕后减压浓缩，制备板分离(二氯甲烷：甲醇＝50∶1v/v)，得到红色化合物s18mg，收率50％。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.72(s,1h),7.82(d,j＝8.8hz,4h),7.16(d,j＝6.8hz,4h),4.31–4.25(m,4h),3.98–3.90(m,4h),3.80–3.74(m,4h),3.65–3.58(m,4h),3.42(s,6h),2.73(s,3h).¹³cnmr(126mhz,cdcl3)δ159.00(2c),154.56,153.16,152.66,147.58(2c),137.37,136.72,133.73(4c),130.10,129.07,127.32,114.13(4c),72.03(2c),70.82(2c),69.79(2c),67.49(2c),59.14(2c),23.40.lr-esi-ms:[m+h]⁺m/z591.3。

实施例2

化合物s2的合成

化合物2(10.0mg,0.021mmol)溶解在1.0ml混合溶剂中(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1v/v)中，0.5mlmgo水溶液(40％)，室温搅拌4h。tlc检测反应完毕后减压浓缩，制备板分离(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1v/v)，得到红色化合物s24.5mg，收率43％。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.70(s,1h),7.52(d,j＝8.8hz,4h),7.08(d,j＝8.8hz,4h),4.22(t,j＝6.0hz,4h),3.93(t,j＝5.8hz,4h),2.74(s,3h),2.10(p,j＝5.8hz,4h)。

实施例3

化合物s3的合成

化合物3(10.0mg,0.017mmol)溶解在1.0ml混合溶剂中(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1v/v)中，0.5mlmgo水溶液(40％)，室温搅拌4h。tlc检测反应完毕后减压浓缩，制备板分离(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1v/v)，得到红色化合物s35.2mg，收率50％。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ8.71(s,1h),7.79(t,j＝8.7hz,4h),7.14(d,j＝8.6hz,4h),4.29(t,j＝4.7hz,4h),3.81–3.72(m,8h),2.94(s,4h),2.80–2.65(m,11h).lr-esi-ms:[m+h]⁺m/z613.3。

实施例4

化合物s4的合成

化合物4(10.0mg,0.0108mmol)溶解在1.0ml混合溶剂中(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1v/v)中，0.5mlmgo水溶液(40％)，室温搅拌4h。tlc检测反应完毕后减压浓缩，c18填料装柱分离(甲醇∶水＝1∶1.5v/v)，得到红色化合物s43.9mg，收率38％。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ8.72(s,1h),8.29(s,2h),7.78(d,j＝5.8hz,4h),7.21(d,j＝8.6hz,4h),5.31(s,4h),4.69(t,j＝3.4hz,4h),4.43–4.16(m,4h),4.10–3.99(m,4h),3.86(d,j＝12.4hz,3h),3.69–3.61(m,3h),3.24–3.15(m,3h),2.69(s,3h)。

实施例5

化合物s5的合成

化合物5(38.0mg,0.017mmol)溶解在1.0ml混合溶剂中(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1v/v)中，0.5mlmgo水溶液(40％)，室温搅拌4h。tlc检测反应完毕后减压浓缩，制备板分离(二氯甲烷：甲醇＝40：1v/v)，得到深蓝色化合物s517mg，收率41.1％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.69(s,1h),7.84(dd,j＝30.3,8.5hz,4h),6.95(d,j＝8.5hz,4h),3.08(d,j＝3.4hz,12h),2.72(s,3h).¹³cnmr(126mhz,cdcl3)δ153.90,153.39,152.90,150.43(2c),147.04,137.33,136.71,133.54(4c),129.84,128.73,122.88(4c),111.76(2c),40.46(4c),23.32。

实施例6

d-a-d近红外荧光分子的性能测定

6.1、d-a-d近红外荧光分子的紫外吸收和荧光发射测量

s1荧光分子溶于dmac中制成1mm/ml母液，置于4℃冰箱保存。测量时稀释，最终溶剂条件为40％dmac，60％ph＝7.410mmpbs，分别测吸收和荧光发射光谱。s1荧光分子最大吸收波长为500nm，发射峰波长范围570–850nm，且最大发射波长为650nm；如图1所示。

6.2、d-a-d近红外荧光分子在神经细胞内的成像应用

将5μl浓度为10μm的s1荧光分子的1％dmso溶液加入到shsy5y细胞内，37℃、5％co2条件下孵育1h，用pbs洗三次。在pbs中，激发光源持续照射，对其进行共聚焦成像(激发波长488nm，收集波长600-900nm)。可以看到明显的红色荧光，并且用激发光源对其进行持续照射的10min内，s1荧光分子的荧光强度不会产生影响，如图2所示。该实验证明所合成的以s1荧光分子为代表的d-a-d近红外荧光分子的成像性能十分优良。