专利名称：一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的fret效率定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测方法，特别是涉及一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法。
背景技术：
荧光共振能量转移(FRET)是一个依赖于距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子。FRET效率(E) 是因发生FRET效应而使供体转移给受体的能量百分比，因E与供受体间距离的六次方成反t匕，对距离的变化非常敏感，测量尺度在纳米范围，FRET技术被广泛应用于研究生物学、化学、医学问题如蛋白质间相互作用和构象的变化。目前应用最为广泛的是荧光寿命测量法(FLIM)和敏化受体发射法(E-FRET)。荧光寿命测量法是目前较为精确的方法，其他E的计算方法一般都以荧光寿命法作为对照，然而荧光寿命测量法所用仪器比较贵重，对激光器和人员技能要求较高，而且测量时间比较长，容易对样品进行光漂白。此外，E-FRET方法能够较为精确的测量E，但受光漂白程度、系统参数、供体激发光串扰和受体发射光串扰的影响，不仅需要多个辅助样品而且整个实验过程中需保证系统参数不变。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种操作简单的、适用于活样品快速定量检测的FRET效率定量检测方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，包括先检测供体再检测受体方法或先检测受体再检测供体方法的处理步骤，其中先检测供体再检测受体方法处理步骤包括A :选用供体激发光激发供体受体对，用供体通道采集供体发射的荧光强度，记为
V；B :选用受体激发光仅激发受体，用受体通道采集受体发射的荧光强度，记为
V；C :利用最大强度的受体激发光漂白部分受体；D :选用供体激发光激发漂白后的供体受体对，用供体通道采集供体发射的荧光强度，记为;E :选用受体激发光仅激发漂白后的受体，用受体通道采集受体发射的荧光强度，记为F :计算部分受体光漂白前后供体通道荧光强度的增加量AId/及受体通道荧光强度的减少量AIa/ AIdd'=IZ'-Idd'；
权利要求
1.一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其特征在于包括先检测供体再检测受体方法或先检测受体再检测供体方法的处理步骤，其中先检测供体再检测受体方法处理步骤包括 A :选用供体激发光激发供体受体对，用供体通道采集供体发射的荧光强度，记为V； B :选用受体激发光仅激发受体，用受体通道采集受体发射的荧光强度，记为Ia/ ； C :利用最大强度的受体激发光漂白部分受体； D :选用供体激发光激发漂白后的供体受体对，用供体通道采集供体发射的荧光强度，记为 E :选用受体激发光仅激发漂白后的受体，用受体通道采集受体发射的荧光强度，记为TpOSt' 1AA ， F :计算部分受体光漂白前后供体通道荧光强度的增加量AId/及受体通道荧光强度的减少量A Ia/
2.根据权利要求I所述的一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其特征在于在扩散不可忽略的样本中，把先检测供体再检测受体方法与先检测受体再检测供体方法分别测量的E'和E"值取平均值作为FRET效率的测量值E。
3.根据权利要求I所述的一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其特征在于激发光源是激光、汞灯、氙灯、LED中的一种。
4.根据权利要求I所述的一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其特征在于部分受体光漂白后做时间序列，步骤C或Cl完成之后，每隔一个任意时间间隔，重复执行步骤D或DI、E或EI，得到数据，If2或
5.根据权利要求I或4所述的一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其特征在于重复执行完步骤D或Dl、E或El后，根据步骤F或Fl所述的公式
6.根据权利要求5所述的一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其特征在于根据G或Gl所述的公式
全文摘要
本发明公开了一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其涉及一种定量检测方法，特别是涉及一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，本发明通过部分光漂白受体，用供体、受体两种激发光交替激发样品，采集受体部分光漂白前后供体通道和受体通道的荧光强度，即可定量获得供体-受体对的FRET效率。该方法直接对待测样品进行检测，不需要任何辅助样品和额外的系统校正与补偿，不仅可以定量检测供体受体浓度比为1:1时FRET效率,而且还可以有效解决一个供体与多个受体存在时的FRET效率定量检测。该方法操作简单，对样品光损伤小，可以对同一个样品进行多次重复检测，可应用于样品中供体受体对FRET效率的快速定量检测中。
文档编号G01N21/64GK102636465SQ201110329899
公开日2012年8月15日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者于怀娜, 陈同生 申请人:华南师范大学