本发明涉及医药，特别是一种从生地黄中提取筋骨草醇的方法及其应用。
背景技术：
生地黄为玄参科植物地黄（rehmanniaglutinosa）的新鲜或干燥块根，是传统补益类中药，《神农本草经》将其列为上品。味甘苦，性寒，归心、肝、肾经，具有滋阴、养血、凉血、填精髓的功效。现代药理研究表明，地黄有保护肾脏、促进血管内皮细胞增殖、调节免疫、降血糖等多种作用。
急性肾损伤（acutekidneyinjury,aki）是一种常见临床急症，以肾功能短时间内急剧下降为特征。其发病机理复杂，氧化应激、细胞凋亡、炎症反应与aki的发生发展密切相关。据2015年发表在lancet上的流行病学调查显示，aki在成人中的发病率是22%，在儿童中是14%，在我国，每年新发170万aki，死亡70万，每年医疗花费约880亿人民币，严重危害人民健康。因此，寻找简便易行、经济又有效的药物，是治疗急性肾损伤的关键所在。
研究发现地黄除常规的功效外，提取物筋骨草醇（ajugol）是生地黄中环烯醚萜类的化学成分。通过tlr4受体降低细胞凋亡率以及细胞内ros水平从而发挥对lps诱导的急性肾损伤的保护作用。但至今未见有筋骨草醇如何从生地黄中提取出来治疗急性肾损伤的公开报道。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从地黄中提取筋骨草醇的方法及其应用，可有效解决从地黄中提取筋骨草醇及在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。
本发明解决的技术方案是，一种从地黄中提取筋骨草醇的方法，该筋骨草醇是从地黄中提取的环烯醚萜类化合物，其制备方法是，将生地黄用体积浓度为95%乙醇在78℃回流提取两次,每次体积浓度为95%乙醇的用量为生地黄重量体积的10倍，重量体积是指固体用g计，液体用毫升计，每次提取2h，合并2次提取液，提取液减压浓缩至无醇味，得浓缩液，浓缩液经离心过滤，滤液上diaionhp-20柱，分别用柱体积的水和甲醇洗脱，得到水部位和甲醇部位，甲醇部位用体积浓度为10%甲醇水溶液离散溶解，离心过滤，滤液再次上diaionhp-20柱，用10倍量的体积浓度为10%甲醇溶液洗脱，洗脱部位经分离纯化重结晶，通过分析鉴定为筋骨草醇（ajugol）。
上述方法制备的筋骨草醇具有显著降低能够显著抑制tlr4表达并且能够降低细胞凋亡率以及细胞内ros水平，通过tlr4受体降低细胞凋亡率以及细胞内ros水平从而发挥对lps诱导的急性肾损伤的保护作用，实现筋骨草醇在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，开辟了生地黄的药用新价值（新用途），是治疗急性肾损伤药物上的创新，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式做详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例实现。
本发明一种从生地黄中提取筋骨草醇的方法，是将生地黄20kg，用体积浓度为95%乙醇在78℃回流提取两次,每次体积浓度为95%乙醇的用量为200l，每次2h，合并2次提取液，提取液减压浓缩至无醇味3000ml，离心过滤，滤液上diaionhp-20柱，分别用柱体积的水和甲醇洗脱，得到水部位和甲醇部位101.2g，甲醇部位再用体积浓度为10%甲醇水溶液离散溶解，离心过滤，滤液再次上diaionhp-20柱，用滤液10倍量的体积浓度为10%甲醇溶液洗脱，洗脱部位经分离纯化重结晶，通过分析鉴定为筋骨草醇（ajugol）。
上述方案制备的筋骨草醇经鉴定和实验具有上述方法制备的筋骨草醇具有显著降低能够显著抑制tlr4表达并且能够降低细胞凋亡率以及细胞内ros水平，通过tlr4受体降低细胞凋亡率以及细胞内ros水平从而发挥对lps诱导的急性肾损伤的保护作用，实现筋骨草醇在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，并经实验得到了充分证明，有关资料如下：
1、提取物的鉴定：按上述方法所得到的提取物，经hmbc波谱鉴定，为无色结晶（甲醇），硅胶tlc检识，1%茴香醛-浓硫酸加热显红棕色(105℃)。在1h-nmr(meod,500mhz)谱中，氢质子比较分散，难以得到优先的结构片段，在δ4.63(1h,d,j=6.0hz,h-1′′)是葡萄糖的端基氢信号，说明结构中有一分子的β-构型的葡萄糖。在13c-nmr(meod,125mhz)中，共有15个碳信号，其中δ99.5(c-1′),74.2(c-2′),77.6(c-3′),71.7(c-4′),77.4(c-5′),62.3(c-6′)是一组葡萄糖的特征信号；其余碳信号结合dept谱可知，有一个季碳信号：δ79.4(c-8)；6个叔碳信号：δ140.1(c-3)和106.5(c-4)是一对双键的碳信号，δ94.5(c-1)是一个缩醛的碳信号，δ77.7(c-6)是一个连氧叔碳信号，δ51.9(c-9)和41.3(c-5)是两个普通叔碳信号；δ50.0(c-7)是一个仲碳信号；δ25.2(c-10)是一个伯碳信号。结合hsqc和1h-1hcosy很容易得到环烯醚萜的结构片段。在hmbc谱中，δh4.63与δc94.5有相关信号，说明葡萄糖连在环烯醚萜的c-1上；δh1.31与δc79.4有相关信号，说明其c-8位上连一个甲基。综上所述，该化合物的结构确定，通过波谱数据与文献[7]对照，鉴定该化合物为筋骨草醇(ajugol)。
筋骨草醇的nmr数据(inmeod)
sixiridoidglycosidesfromrehmanniaglutinosa*
hiroakinishimura,hiroshisasaki,takashimorota,masaochin(chenzhengxiong)andhiroshi
mitsuhashi
phytochemrstry,vol28,no10,pp2705-27091,989
nishimurah,sasakih,morotat,etal.sixiridoidglycosidesfromrehmanniaglutinosa[j].phytochemrstry,1989,28(10):2705-2709.
2、提取物活性实验
1.1实验药物
本发明从生地黄中提取的筋骨草醇，生地黄采用河南省焦作市温县生地黄，实验前取筋骨草醇结晶样本溶于水，配成筋骨草醇含量为2mg/ml的水溶液。
实验动物
spf级雄性babl/c小鼠，体重18～22g；由北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证号:scxk京2016-0001。
仪器与试剂
酶标仪(bio-rad680)；centrifuge-5804r小型高速冷冻离心机（eppendorf公司）；bdfacsariaiii流式细胞仪（bdbiosciences）；微量加样器（eppendorf公司）；odessey双色红外激光成像系统（li-cor公司）；半干转膜仪（bio-rad）；wd-9405b型水平摇床（北京市六一仪器厂）；dyy-24dn电泳仪（北京市六一仪器厂）；脂多糖（lps，sigma公司）；一抗tlr4(abcam公司，ab22048)；羊抗兔二抗（li-cor公司，批号925-68071）；annexinv-pe/7-aad凋亡检测试剂盒（bdbiosciences,7310941）；活性氧ros检测试剂盒（bdbiosciences）。
实验方法
2.1动物分组与造模
将实验小鼠随机分为三组，即正常组（con组）、模型组（lps组）、筋骨草醇组（lps+jgcc组），每组10只。正常组和模型组每天按照20mg/kg灌胃蒸馏水，筋骨草醇组按照20mg/kg灌胃筋骨草醇溶液，持续灌胃三天。第三天灌胃半小时后lps组和lps+jgcc组腹腔注射lps（5mg/kg），正常组腹腔注射生理盐水。半小时后，各组再次灌胃，6h后脱颈椎处死动物，立即摘取双侧肾脏，置于-80℃冰箱备用。
肾脏病理检查
取左侧肾脏，快速去除肾包膜浸于10%甲醛溶液固定，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片厚5mm，用苏木精-伊红（he）染色，在光学显微镜下观察肾组织形态变化。实验平行重复三次。
原代肾细胞凋亡检测
取新鲜右侧肾组织，快速去除肾包膜剪碎，加入pbs清洗，离心弃上清，重复清洗两次。然后加入1ml胰酶消化，3min后立即加入胎牛血清终止消化，用70um滤网过滤，收集滤液，1500r/min离心5min，弃上清得原代细胞，各加入100μl1xbindingbuffer，转移至流式管。通过annexinv-pe/7-aad方法检测并分析细胞凋亡情况。
原代肾细胞活性氧（ros）检测
原代肾细胞提取同2.3。按照ros检测试剂盒说明书配制样本，流式细胞仪检测并分析细胞ros水平变化。
蛋白印迹法(westernblot)检测肾脏中tlr4（革兰阴性菌lps的主要信号受体）表达
取出冻存的肾脏组织，按照总蛋白提取试剂盒操作，提取各组小鼠肾脏总蛋白，用bca蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)将蛋白按照相对分子质量的大小分离成不同的条带，将内参蛋白和目的蛋白转移到pvdf膜上，用5%的脱脂奶粉于摇床封闭1h，分别加入一抗tlr4（1:500）和兔源内参蛋白β-αctin（1：1000），室温孵育0.5h后，4℃冰箱孵育过夜，用pbst洗涤5次，每次5min，加入荧光二抗(1:20000)，室温避光孵育1h，再次用pbst洗涤5次，用odyssey双色红外激光成像系统进行扫描分析。实验平行重复三次。结果与正常组相比，计算p值，考察有无统计学意义。
统计学处理
实验数据以
实验结果
4.1筋骨草醇对急性肾损伤小鼠肾组织病理变化的影响
病理结果显示，光学显微镜下正常组小鼠肾小管管壁完整，管腔通畅，未见到明显渗出物，肾单位组织结构清晰。而lps组肾组织出现病变，肾小管上皮细胞萎缩或扩张，肾组织水肿明显，较多的炎症细胞浸润。lps+jgcc组肾小球、肾间质及肾小管炎症病变明显减轻，肾组织炎性细胞浸润较模型组减轻。
筋骨草醇对急性肾损伤小鼠原代肾细胞凋亡的影响
与正常组相比，lps组小鼠原代肾细胞的凋亡率显著性升高，给药筋骨草醇后，小鼠原代肾细胞的凋亡率出现显著性降低。
筋骨草醇对急性肾损伤小鼠原代肾细胞ros变化的影响
与正常组相比，lps组小鼠原代肾细胞内ros水平显著升高，给药筋骨草醇后，小鼠原代肾细胞内ros水平显著降低。
筋骨草醇对急性肾损伤小鼠tlr4含量的影响
与正常组相比，lps组小鼠肾脏组织的tlr4表达水平显著升高，给药筋骨草醇后，肾脏组织的tlr4表达水平显著降低。
全身性炎症反应综合征(systemicinflam-matoryresponsesyndrome，sirs)引起的败血症是一种威胁生命的疾病，伴有多器官损伤。而单独由急性肾功能损伤造成的死亡率就达45%，故急性肾功能损伤是sirs死亡率高的主要原因之一。众所周知，脂多糖（lps）是诱导sirs条件动物模型的工具药物，被广泛用于全身性炎症反应综合征机制的探索。故本研究采用腹腔注射（i.p.）lps5mg/kg制备小鼠急性肾损伤模型，研究筋骨草醇对急性肾损伤的保护作用。
急性肾损伤的机制较为复杂，许多学者认为可能是感染时所释放的毒素以及活化的炎性细胞和炎症介质释放，激活toll样受体4，经过一系列级联信号传递，相互促进，形成炎症瀑布，启动后续的一系列病理生理改变从而导致急性肾损伤。tlr4作为革兰阴性菌lps的主要信号受体，在与lps识别后，tlr4激活诱导固有免疫应答，包括调节促炎细胞因子的基因编码，从而活化转录因子，进而诱导细胞内信号转导途径。lps与tlr4受体结合后产生的多种炎症因子和细胞毒性物质能够引起细胞凋亡以及细胞内ros水平升高。本实验研究表明，lps诱导小鼠肾组织中tlr4蛋白表达水平升高，肾原代细胞凋亡增加以及细胞内ros水平增加，然而筋骨草醇能够显著抑制tlr4表达并且能够降低细胞凋亡率以及细胞内ros水平。推测筋骨草醇可能是通过tlr4受体降低细胞凋亡率以及细胞内ros水平从而发挥对lps诱导的小鼠急性肾损伤的保护作用，从而达到筋骨草醇在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，开拓了生地黄的药用新用途，提高了生地黄的商业价值，有显著的经济和社会效益。