本发明涉及生物活性物质提取
技术领域：
，尤其是涉及一种桑叶活性物质的提取方法。
背景技术：
：中国是蚕桑产业的发源地，也是桑树种植面积最大的国家之一，拥有丰富的桑树品种资源。桑树是落叶性多年生木本植物，自古以来就被认作是药食两用的珍贵材料，现代科学也已经证实了桑树资源的营养成分、药理活性成分及作用机理。桑叶，为桑科(moraceae)桑属植物桑(morusalbal.)的叶。因其具有疏风散热，润燥清肺，清肝明目的作用，较广泛的用于治疗风热感冒，头晕头痛，肺热燥咳，目赤昏花。很多研究表明桑叶具有显著的降血糖功能，现代药理研究证明桑叶可以抑制血糖上升，因此可以预防和治疗糖尿病。桑叶的主要有效成分有黄酮类、生物碱、植物甾醇、γ－氨基丁酸、桑叶多糖等。多糖是极性大分子物质，国内外研究证明，植物、动物及菌类中均含有天然多糖，具有降血糖、降血脂、消除自由基、抗肿瘤、抑制细菌生长及增强免疫力等功能。桑叶多糖是一种较为常见的生物多糖，中国是桑叶主要产地，大约有83万hm2的种植面积，年产桑叶1500多万t，提取桑叶多糖的原料十分丰富。桑叶多糖是桑叶中的主要活性物质之一。近年来人们对桑叶多糖进行了大量集中的研究，发现桑叶多糖具有明显的降血糖、降血脂和抗氧化等活性作用，并能促进免疫调节，在药品和保健食品产业化开发和应用方面具有广阔前景。目前，对于桑叶多糖的提取主要有热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、酶提取法、超声波提取法及微波提取法等。热水浸提法是以水作为提取剂，无污染且对多糖结构不易造成破坏，但是需要反复提取多次，提取时间久且提取率不高。酸碱提取由于提取液为酸性或碱性容易破坏多糖的立体结构，而且提取后还需中和其ph，程序复杂，多不为采用。酶提取法操作条件温和，提取过程使桑叶多糖的生物活性得到保护，是一种具有较大潜力的桑叶多糖提取方法。超声波提取法是利用超声波产生的强烈、高速的空化效应及搅拌作用破坏植物细胞的细胞膜，加速细胞内有效活性成分的释放与溶出，与传统的提取法相比，超声波提取法提取效率高，提取速度快，因此具有广阔的应用前景。微波提取法是用微波处理溶剂，微波穿过细胞壁达到细胞内部，瞬间增加细胞内温度和压力，不断增强的压力使细胞壁破裂，细胞质内的多糖等物质便释放到细胞外的溶剂中，溶解于溶剂。微波技术能有效提高目的物的回收率，近年来在天然产物提取研究中被广泛应用。基于上述几种桑叶多糖提取方法，热水浸提法作为传统的桑叶多糖提取方法，目前被普遍采用，原因在于这种方法操作简单，对提取设备要求低，但同时也存在诸多缺点，如多糖回收率易受料液比、提取温度、提取次数、提取时间及桑叶粉碎程度等因素影响，且多糖的生物活性也很容易受提取时间和温度影响，导致多糖回收率低。现有技术如授权公告号为cn101036698b的中国发明专利，公开了一种桑叶提取物及其制备方法与应用工艺，其主要步骤为：桑叶通过超声波处理、经水提与薄膜浓缩得到，含有多糖类(纯度12％以下)、黄酮及黄酮苷(纯度5％以下)、生物碱(纯度0.8％以上)、甾醇类、维生素类、氨基酸类等多种功能物质。该方法不足之处在于，获得的多种成分提取物含量过低，且未经分离商业收益少。现有技术如授权公告号为cn105272988b的中国发明专利，公开了一种桑叶有效成分的统筹提取方法，是以桑叶为原料，依次经超声醇提、水提获得醇提液、水提液和提取后滤渣，其中醇提液经浓缩、萃取脱色后，使用阴阳离子交换树脂富集、洗脱制得桑叶黄酮和dnj，脱除的色素经皂化、铜代、成盐后制得叶绿素铜钠盐；水提液经浓缩后醇沉、澄清剂澄清分离蛋白、多糖，多糖喷雾干燥制得桑叶多糖，蛋白加入酶水解，制成小分子低聚肽；提取后残渣经超声酸碱洗涤，乙醇浸泡脱脂后制得桑叶膳食纤维；通过统筹工艺，将桑叶“一站”式完全分解，制成6种主要产品。该方法不足之处为操作复杂，且对于桑叶活性物质提取没有具体的针对性。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种操作简单、快速、无污染，桑叶脱脂率高、脱蛋白效果好，活性物质收率较高的桑叶活性物质的提取方法。本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案如下：一种桑叶活性物质的提取方法，包括桑叶脱脂预处理、超声波辅助提取、脱蛋白、大孔吸附树脂d301g处理、超滤和真空冷冻干燥，具体步骤如下：桑叶脱脂预处理：将桑叶洗净，置于60-95％乙醇溶液中浸泡16-24h，干燥，粉碎，过40-50目筛，阴凉处风干得桑叶干粉；乙醇中含有0.3-0.5％的pvp(聚乙烯吡咯烷酮)和0.1-0.3％的苦马豆素，pvp和苦马豆素发挥增效作用，一方面能够溶解桑叶细胞壁上的磷脂使细胞壁产生孔隙，助于乙醇溶液进入桑叶细胞，不断增加细胞内渗透压，从而加速细胞壁破裂，使得桑叶细胞中的脂肪、脂溶性色素和一些小分子杂质溢出，增加了其在乙醇中的溶解，同时提高了溶解速率，最终提高脱脂效率；另一方面能够直接氧化桑叶中的芦丁和桑色素等黄酮类物质，有利于进一步纯化桑叶活性物质；超声波辅助提取：将桑叶粉与水溶液按比例w/v为1:6-14混合均匀，在温度40-100℃，超声功率100-600w、频率6-10khz条件下超声20-60min，离心收集上清液，重复提取2-3次，合并所有的上清液充分混合后得桑叶提取液；在加热条件下，将桑叶干粉通过高速剪切搅拌均匀地分散在溶剂中，通过超声的机械和空化效应使桑叶细胞中的有效成分透过细胞快速的溶解在溶剂中缩短反应时间，提高提取效率；脱蛋白：采用冻融循环处理技术脱除桑叶提取液中的蛋白质杂质；其中，在冻融及冻融循环处理过程中，盛装提取液的容器为圆形聚乙烯塑料瓶，溶液盛装量为直径和高度比是1:5-1:9；采用冻融循环处理技术，整个脱蛋白过程不使用有机溶剂，相对于多糖脱蛋白的传统sevage法，不仅具有绿色无污染和多糖回收率高的优点，而且操作安全、方便，成本低，保护环境，利于工业化生产；大孔吸附树脂d301g处理：将脱蛋白桑叶提取液加入经预处理的d301g树脂层析柱中，收集流出液；所述的预处理是指，大孔吸附树脂d301g先用水浸泡20-24h，用水洗至澄清，倾去水后加1-2mhc1溶液浸泡20-24h，水洗至中性，加1-2mnaoh溶液浸泡20-24h，用水洗至中性；采用大孔树脂进行脱色精制，无毒副作用，操作更加简便，纯化效果好，多糖保留率和得率高；超滤：采用超滤膜分子量为6000-12000da的中空纤维素膜进行超滤，得桑叶多糖样品；真空冷冻干燥：将桑叶多糖样品于-10～-20℃下冷冻1-2h，然后转入-60～-80℃下冷冻6-8h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桑叶多糖。作为优选，脱蛋白的具体步骤如下：冻融：在桑叶提取液中加入重量比为0.5-1.5％的含水量为20％的dmso(二甲基亚砜)和重量比为1.5-2.5％的pvp，搅拌均匀后于-10～-20℃下冷冻贮藏80-100h；达到冷冻贮藏时间后，将冻结的桑叶提取液于4-10℃恒温环境中自然解冻；dmso和pvp的特殊存在，一方面能够和桑叶提取液中的水分子结合，发生水合作用，对桑叶提取液中蛋白质表层的水化膜构成破坏，致使蛋白质易于聚集形成沉淀，同时由于dmso和pvp能够降低桑叶提取液的介电常数，增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀，从而提高桑叶提取液中蛋白质的脱除率；另一方面能够弱化冻融过程中水的结晶，降低冰晶的生长速率和体积，进而降低冻融对桑叶活性物质的机械损伤，对桑叶活性物质的稳定性具有一定的保护作用；冻融循环：将解冻液重复冻融循环处理3-5次；通过反复冻融处理，蛋白出现一定程度的聚集，浊度增加，有利于桑叶提取液中蛋白质杂质的分离；沉淀分离：完成冻融循环处理的解冻液，于3000-4000rpm下离心40-45min，收集上清液；上清液经0.45-0.60μm水系滤膜过滤分离，收集滤液得脱蛋白桑叶提取液。作为优选，大孔吸附树脂d301g处理是指，将脱蛋白桑叶提取液加入经预处理的d301g树脂层析柱中，按照d301g树脂︰脱蛋白桑叶提取液＝1.2-2.0︰1(w/v)，流速控制在1-3ml/min(优选的，按照d301g树脂︰脱蛋白桑叶提取液＝1.5-1.8︰1(w/v)，流速控制在1.5-2ml/min，更加优选的，按照d301g树脂︰脱蛋白桑叶提取液＝1.6︰1(w/v)，流速控制在1.8ml/min)，收集流出液；更加优选的，所述的预处理是指，大孔吸附树脂d301g先用水浸泡24h，用水洗至澄清，倾去水后加1mhc1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1mnaoh溶液浸泡24h，用水洗至中性；与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提取桑叶活性物质得率较高，并且具有操作时间短，无污染的优点，因此适合工业生产，在工业化提取桑叶活性物质方面具有广阔的应用前景；(2)采用本发明提取的桑叶活性物质，桑叶脱脂效率高，脱蛋白效果好，多糖保留率和得率高；而sevage法，所用氯仿有毒性，且回收不便，得率较低；活性炭吸附法和过氧化氢法去除色素，均存在一定的缺陷，活性炭吸附法脱色时间长且多糖损失率较大，而且活性炭难以除去，过氧化氢脱色，对多糖的化学结构和生物活性破坏性极大。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：一种桑叶活性物质的提取方法，包括桑叶脱脂预处理、超声波辅助提取、脱蛋白、大孔吸附树脂d301g处理、超滤和真空冷冻干燥，具体步骤如下：1)桑叶脱脂预处理：将桑叶洗净，置于60％乙醇溶液中浸泡16h，干燥，粉碎，过40目筛，阴凉处风干得桑叶干粉；乙醇溶液中含有0.3％的pvp和0.1％的苦马豆素，pvp和苦马豆素发挥增效作用，一方面能够溶解桑叶细胞壁上的磷脂使细胞壁产生孔隙，助于乙醇溶液进入桑叶细胞，不断增加细胞内渗透压，从而加速细胞壁破裂，使得桑叶细胞中的脂肪、脂溶性色素和一些小分子杂质溢出，增加了其在乙醇中的溶解，同时提高了溶解速率，最终提高脱脂效率；另一方面能够直接氧化桑叶中的芦丁和桑色素等黄酮类物质，有利于进一步纯化桑叶活性物质；2)超声波辅助提取：将桑叶粉与水溶液按比例w/v为1:6混合均匀，在温度40℃，超声功率100w、频率6khz条件下超声提取20min，离心收集上清液，重复提取2次，合并所有的上清液充分混合后得桑叶提取液；3)脱蛋白：采用冻融循环处理技术脱除桑叶提取液中的蛋白质杂质，具体步骤如下：冻融：在桑叶提取液中加入重量比为0.5％的含水量为20％的dmso和重量比为1.5％的pvp，搅拌均匀后于-10℃下冷冻贮藏80h；达到冷冻贮藏时间后，将冻结的桑叶提取液于4℃恒温环境中自然解冻；dmso和pvp的特殊存在，一方面能够和桑叶提取液中的水分子结合，发生水合作用，对桑叶提取液中蛋白质表层的水化膜构成破坏，致使蛋白质易于聚集形成沉淀，同时由于dmso和pvp能够降低桑叶提取液的介电常数，增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀，从而提高桑叶提取液中蛋白质的脱除率；另一方面能够弱化冻融过程中水的结晶，降低冰晶的生长速率和体积，进而降低冻融对桑叶活性物质的机械损伤，对桑叶活性物质的稳定性具有一定的保护作用；冻融循环：将解冻液重复冻融循环处理3次；沉淀分离：完成冻融循环处理的解冻液，于3000rpm下离心40min，收集上清液；上清液经0.45μm水系滤膜过滤分离，收集滤液得脱蛋白桑叶提取液；4)大孔吸附树脂d301g处理：将脱蛋白桑叶提取液加入经预处理(大孔吸附树脂d301g先用水浸泡24h，用水洗至澄清，倾去水后加1mhc1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1mnaoh溶液浸泡24h，用水洗至中性)的d301g树脂层析柱中，按照d301g树脂︰脱蛋白桑叶提取液＝1.2︰1(w/v)，流速控制在1ml/min收集流出液；5)超滤：采用超滤膜分子量为6000da的中空纤维素膜进行超滤，得桑叶多糖样品；6)真空冷冻干燥：将桑叶多糖样品于-10℃下冷冻1h，然后转入-60℃下冷冻6h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桑叶多糖。实施例2：一种桑叶活性物质的提取方法，包括桑叶脱脂预处理、超声波辅助提取、脱蛋白、大孔吸附树脂d301g处理、超滤和真空冷冻干燥，具体步骤如下：1)桑叶脱脂预处理：将桑叶洗净，置于80％乙醇溶液中浸泡20h，干燥，粉碎，过40目筛，阴凉处风干得桑叶干粉；乙醇溶液中含有0.4％的pvp和0.2％的苦马豆素，乙醇中含有0.3-0.5％的pvp和0.1-0.3％的苦马豆素，pvp和苦马豆素发挥增效作用，一方面能够溶解桑叶细胞壁上的磷脂使细胞壁产生孔隙，助于乙醇溶液进入桑叶细胞，不断增加细胞内渗透压，从而加速细胞壁破裂，使得桑叶细胞中的脂肪、脂溶性色素和一些小分子杂质溢出，增加了其在乙醇中的溶解，同时提高了溶解速率，最终提高脱脂效率；另一方面能够直接氧化桑叶中的芦丁和桑色素等黄酮类物质，有利于进一步纯化桑叶活性物质；2)超声波辅助提取：将桑叶粉与水溶液按比例w/v为1:10混合均匀，在温度80℃，超声功率500w、频率8khz条件下超声提取40min，离心收集上清液，重复提取3次，合并所有的上清液充分混合后得桑叶提取液；3)脱蛋白：采用冻融循环处理技术脱除桑叶提取液中的蛋白质杂质，具体步骤如下：冻融：在桑叶提取液中加入重量比为1.0％的含水量为20％的dmso和重量比为2.0％的pvp，搅拌均匀后于-15℃下冷冻贮藏90h；达到冷冻贮藏时间后，将冻结的桑叶提取液于8℃恒温环境中自然解冻；dmso和pvp的特殊存在，一方面能够和桑叶提取液中的水分子结合，发生水合作用，对桑叶提取液中蛋白质表层的水化膜构成破坏，致使蛋白质易于聚集形成沉淀，同时由于dmso和pvp能够降低桑叶提取液的介电常数，增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀，从而提高桑叶提取液中蛋白质的脱除率；另一方面能够弱化冻融过程中水的结晶，降低冰晶的生长速率和体积，进而降低冻融对桑叶活性物质的机械损伤，对桑叶活性物质的稳定性具有一定的保护作用；冻融循环：将解冻液重复冻融循环处理5次；沉淀分离：完成冻融循环处理的解冻液，于3000rpm下离心40min，收集上清液；上清液经0.45μm水系滤膜过滤分离，收集滤液得脱蛋白桑叶提取液；4)大孔吸附树脂d301g处理：将脱蛋白桑叶提取液加入经预处理(大孔吸附树脂d301g先用水浸泡24h，用水洗至澄清，倾去水后加1mhc1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1mnaoh溶液浸泡24h，用水洗至中性)的d301g树脂层析柱中，按照d301g树脂︰脱蛋白桑叶提取液＝1.6︰1(w/v)，流速控制在1.8ml/min收集流出液；5)超滤：采用超滤膜分子量为10000da的中空纤维素膜进行超滤，得桑叶多糖样品；6)真空冷冻干燥：将桑叶多糖样品于-15℃下冷冻2h，然后转入-70℃下冷冻6h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桑叶多糖。实施例3：一种桑叶活性物质的提取方法，包括桑叶脱脂预处理、超声波辅助提取、脱蛋白、大孔吸附树脂d301g处理、超滤和真空冷冻干燥，具体步骤如下：1)桑叶脱脂预处理：将桑叶洗净，置于95％乙醇溶液中浸泡24h，干燥，粉碎，过50目筛，阴凉处风干得桑叶干粉；乙醇溶液中含有0.5％的pvp和0.3％的苦马豆素，乙醇中含有0.3-0.5％的pvp和0.1-0.3％的苦马豆素，pvp和苦马豆素发挥增效作用，一方面能够溶解桑叶细胞壁上的磷脂使细胞壁产生孔隙，助于乙醇溶液进入桑叶细胞，不断增加细胞内渗透压，从而加速细胞壁破裂，使得桑叶细胞中的脂肪、脂溶性色素和一些小分子杂质溢出，增加了其在乙醇中的溶解，同时提高了溶解速率，最终提高脱脂效率；另一方面能够直接氧化桑叶中的芦丁和桑色素等黄酮类物质，有利于进一步纯化桑叶活性物质；2)超声波辅助提取：将桑叶粉与水溶液按比例w/v为1:14混合均匀，在温度100℃，超声功率600w、频率10khz条件下超声提取60min，离心收集上清液，重复提取3次，合并所有的上清液充分混合后得桑叶提取液；3)脱蛋白：采用冻融循环处理技术脱除桑叶提取液中的蛋白质杂质，具体步骤如下：冻融：在桑叶提取液中加入重量比为1.5％的含水量为20％的dmso和重量比为2.5％的pvp，搅拌均匀后于-20℃下冷冻贮藏100h；达到冷冻贮藏时间后，将冻结的桑叶提取液于10℃恒温环境中自然解冻；dmso和pvp的特殊存在，一方面能够和桑叶提取液中的水分子结合，发生水合作用，对桑叶提取液中蛋白质表层的水化膜构成破坏，致使蛋白质易于聚集形成沉淀，同时由于dmso和pvp能够降低桑叶提取液的介电常数，增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀，从而提高桑叶提取液中蛋白质的脱除率；另一方面能够弱化冻融过程中水的结晶，降低冰晶的生长速率和体积，进而降低冻融对桑叶活性物质的机械损伤，对桑叶活性物质的稳定性具有一定的保护作用；冻融循环：将解冻液重复冻融循环处理5次；沉淀分离：完成冻融循环处理的解冻液，于4000rpm下离心45min，收集上清液；上清液经0.60μm水系滤膜过滤分离，收集滤液得脱蛋白桑叶提取液；4)大孔吸附树脂d301g处理：将脱蛋白桑叶提取液加入经预处理(大孔吸附树脂d301g先用水浸泡24h，用水洗至澄清，倾去水后加1mhc1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1mnaoh溶液浸泡24h，用水洗至中性)的d301g树脂层析柱中，按照d301g树脂︰脱蛋白桑叶提取液＝2.0︰1(w/v)，流速控制在3ml/min收集流出液；5)超滤：采用超滤膜分子量为12000da的中空纤维素膜进行超滤，得桑叶多糖样品；6)真空冷冻干燥：将桑叶多糖样品于-20℃下冷冻2h，然后转入-80℃下冷冻8h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桑叶多糖。对比例1：桑叶脱脂预处理中乙醇溶液中未添加pvp和苦马豆素，其余部分和实施例2完全一致。对比例2：脱蛋白冻融过程中，桑叶提取液中未添加dmso和pvp，其余部分和实施例2完全一致。实施例4：将实施例2设为试验组，对比例1、对比例2分别设为对照组1、对照组2。桑叶多糖收率、色素去除率和蛋白去除率的测定：采用苯酚硫酸法、比色法、考马斯亮蓝法分别测定脱蛋白桑叶提取液的多糖含量、色素含量以及蛋白质含量，其结果如表1所示。由表1可知，试验组的桑叶多糖收率高于对照组1和对照组2，说明色素及蛋白的去除率会较大程度影响桑叶多糖的收率；而pvp和苦马豆素通过协同增效，对色素的去除效果好，dmso和pvp通过协同增效则有助于冻融过程中蛋白质杂质更好的去除。表1测定结果项目桑叶多糖收率(％)色素去除率(％)蛋白的去除率(％)试验组86.0268.4687.18对照组183.1160.5585.27对照组281.9265.3579.63本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12