一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE105及其应用的制作方法

本发明属于分子标记技术领域，涉及一种检测甜菜种子粒性的ssr分子标记及其应用。

背景技术：

甜菜(betavulgaris)的果实外包被着宿存的木质化花萼，形成比较特殊的“种球”结构：当花单生时，种球内为单个的瘦果，而当多个无柄小花聚生成聚伞花序时，种球内多个果实紧密相连形成含有多个瘦果的聚花果。描述甜菜种质资源时，以“种子粒性”性状进行描述，分为单粒种(又称单胚种)与多粒种(又称多胚种)。

多粒种出苗率高，利于保苗，单粒种则利于机械化栽培，且节省间苗工作量。同时，单粒种易于控制株距，有助于提高丰产性和整齐度。随着播种、管理机械化程度的提高，以及种子包衣和丸粒化技术的进步，生产上对甜菜单粒种的需求正在不断提高。

目前，我国的单粒种甜菜种质大部分通过引进与引种获得，也自主培育了少数单粒种，但是甜菜种子粒性相关分子标记、基因及分子机理的研究尚无报道。

开发种子粒性标记，应用于种子粒性预测，有利于我国甜菜单粒种种质的鉴定、开发与利用，也有利于提高单粒种培育工作的效率，同时有助于寻找粒性相关基因，供育种应用与分子机理研究。

技术实现要素：

本发明是要解决现有缺乏甜菜种子粒性相关的分子标记，不易于鉴定种子粒性的问题，提供一种检测甜菜种子粒性的ssr分子标记bvre105及其应用。

本发明利用高通量测序技术开发了简单序列重复(simplesequencerepeat,ssr)候选标记，利用f2分离群体从中筛选出了与甜菜种子粒性相关的ssr分子标记bvre105，获得了标记扩增区域的序列并进行了基因组定位。该分子标记可用于检测甜菜种子单粒/多粒个体。

本发明检测甜菜种子粒性的ssr分子标记bvre105，用于pcr扩增该分子标记的引物对为bvre105s和bvre105a，具体序列为：

bvre105s：5'-tcaccaggattaaccaagcc-3'

bvre105a：5'-acttccacgtctttgcaacc-3'。

上述检测甜菜种子粒性的ssr分子标记bvre105的应用，它用于检测种子粒性。

具体检测方法为：

一、从甜菜幼嫩组织中分离提取总dna；所述幼嫩组织为幼嫩叶片、幼嫩花序、幼嫩叶柄、幼嫩花薹、萌发期种子、幼苗期根或整株幼苗；

二、以步骤一得到的dna为模板，采用引物bvre105s和bvre105a进行pcr扩增，

三、将步骤二得到的pcr扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,page)进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到219bp的条带，则判定为甜菜种子单粒；如果检测到207bp的条带、231bp的条带和279bp的条带，则判定为甜菜种子多粒。

步骤二所述引物bvre105s为5'-tcaccaggattaaccaagcc-3'，引物bvre105a为5'-acttccacgtctttgcaacc-3'。

进一步的，步骤二所述的pcr扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。

本发明的有益效果：

本发明获得了与甜菜种子粒性相关的ssr分子标记bvre105，可单独使用或者与其它引物联合使用，通过pcr检测，可对甜菜的种子粒性进行预先判断；可在甜菜任何生长时期，取甜菜幼嫩叶片或其它幼嫩组织提取基因组dna作为材料，减少工作量，缩短种子粒性判断的周期；可对多株甜菜个体进行检测，判断种质在粒性性状上的纯合度。

本发明分别对分离世代多粒种与单粒种个体进行基因分型，验证标记与种子粒性表现的一致性。发现本发明的分子标记bvre105在所有个体中，标记检测结果与种子粒性性状表现的一致性达到70％，在单粒与多粒个体中分别达到86.87％和53.33％，表明bvre105与种子粒性有连锁关系，可用于种子粒性的检测。

将标记扩增区域的序列与甜菜基因组进行比对，对标记进行基因组定位。结果表明bvre105分子标记定位于甜菜基因组中7号染色体的39071516-39071279区域。

bvre105分子标记用于甜菜单粒种/多粒种种质的辅助选择和甜菜个体与后代粒性的预测，并辅助甜菜开花与种球形成的理论研究及甜菜种子粒性相关基因的挖掘。

附图说明

图1为甜菜种子单粒个体的基因分型结果；

图2为甜菜种子多粒个体的基因分型结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式检测甜菜种子粒性的ssr分子标记bvre105，用于pcr扩增该分子标记的引物对为bvre105s和bvre105a，具体序列为：

bvre105s：5'-tcaccaggattaaccaagcc-3'

bvre105a：5'-acttccacgtctttgcaacc-3'。

本实施方式的分子标记可用于判断甜菜种质或个体的种子粒性。在使用时，直接取一年生植株幼嫩叶片或其它幼嫩组织进行dna提取与标记检测，不需要进行耗时两年的播种-母根培育-母根栽植-二年生植株性状调查工作；也可取二年生植株幼嫩叶片、幼嫩花序或其它幼嫩组织进行dna提取与标记检测。用于判断整个种质的粒性时，可直接根据pcr结果结合统计学分析进行判断，或对其中重点个体进行性状调查作为补充，而不需要对全部个体进行检测。用于判断甜菜个体的育性时，也可根据pcr结果在一年生阶段或二年生抽薹初期、现蕾初期取幼嫩叶片、幼嫩花序或其它幼嫩组织即进行预判，缩小性状调查个体的范围，提前淘汰不需要的单粒/多粒个体。

具体实施方式二：本实施方式检测甜菜种子粒性的ssr分子标记bvre105的应用，它用于检测种子粒性。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：具体检测方法为：

一、从甜菜幼嫩组织中分离提取总dna；

二、以步骤一得到的dna为模板，采用引物bvre105s和bvre105a进行pcr扩增，

三、将步骤二得到的pcr扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到219bp的条带，则判定为甜菜种子单粒；如果检测到207bp的条带、231bp的条带和279bp的条带，则判定为甜菜种子多粒。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：步骤一中所述幼嫩组织为幼嫩叶片、幼嫩花序、幼嫩叶柄、幼嫩花薹、萌发期种子、幼苗期根或整株幼苗。其它与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤二所述引物bvre105s为5'-tcaccaggattaaccaagcc-3'，引物bvre105a为5'-acttccacgtctttgcaacc-3'。其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤二所述的pcr扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。其它与具体实施方式二至五之一相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

通过高通量测序获得了大量甜菜序列，从中挖掘出了未经报道的ssr标记，筛选出质量与多态性良好的候选标记一百余个，同时构建了甜菜种子粒性的f2分离群体。

自分离世代中选取多粒种与单粒种个体构建混池，用集团混合分离分析(bulkedsegregationanalysis,bsa)的方法对候选标记进行筛选，获得了在混池间表现出多态性的ssr标记。并从中选择出了与甜菜种子粒性相关的ssr分子标记，命名为bvre105。

(一)标记对种子粒性的检测

一、分别提取30株甜菜幼嫩叶片的dna；

二、以步骤一得到的dna为模板，采用引物bvre105s和bvre105a进行pcr扩增，pcr反应体系如表1所示：

bvre105s：5'-tcaccaggattaaccaagcc-3'

bvre105a：5'-acttccacgtctttgcaacc-3'

表1

pcr扩增反应的条件为：

94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。

三、结果的检测方法：

将步骤二得到的pcr扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，凝胶交联度8％，电泳时电压100v，时间5h。电泳后用10mg/l溴化乙锭(eb)溶液染色15～20min。

对分离世代种子粒性进行调查后，分别对单粒与多粒个体各30株进行了标记的基因分型。单粒的基因分型结果如图1所示，其中m表示dna50bpmarker，p1表示母本(单粒)，p2表示父本(多粒)，编号1-30为30个单粒个体。多粒的基因分型结果如图2所示，其中m表示dna50bpmarker，p1表示母本(单粒)，p2表示父本(多粒)，编号1-30为30个多粒个体。

分别对分离世代多粒种与单粒种个体进行基因分型，验证标记与种子粒性表现的一致性。发现分子标记bvre105在所有个体中，标记检测结果与种子粒性性状表现的一致性达到70％，在单粒与多粒个体中分别达到86.87％和53.33％。表明bvre105与种子粒性有连锁关系，可用于种子粒性的检测。

表2种子粒性相关标记对不同粒性植株的检测结果

根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到219bp的条带，则判定为甜菜种子单粒；如果检测到207bp的条带、231bp的条带和279bp的条带，则判定为甜菜种子多粒。

(二)标记扩增区域序列的获得

通过pcr产物回收、t-a克隆和sanger测序，获得了标记的扩增序列。

经测序，bvre105扩增序列如下(划线部分为ssr重复单元)：

单粒相关条带：219bp

aaggcaaggaacagaagcagcagtcttaatcatttgtggagcttcagtaatgataactggagaacctatgcttaacttagatgcatctctctttggtacttctgcagaaaaatcttgttcattcagctcacacttggaagtaaaatctcgggttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagtttgaaatccaatattaggttgcaaagacgtggaagt

多粒相关条带1：207bp

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多粒相关条带2：231bp

aaggcaaggaacagaagcagcagtcttaatcatttgtggagcttcagtaatgataactggagaacctatgcttaacttagatgcatctctctttggtacttctgcagaaaaatcttgttcattcagctcacacttggaagtaaaatctcgggttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagtttgaaatccaatattaggttgcaaagacgtggaagt

多粒相关条带3：279bp

aaggcaaggaacagaagcagcagtcttaatcatttgtggagcttcagtaatgataactggagaacctatgcttaacttagatgcatctctctttggtacttctgcagaaaaatcttgttcattcagctcacacttggaagtaaaatctcgggttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagtttgaaatccaatattaggttgcaaagacgtggaagt

(三)标记扩增区域序列的分析与基因组定位

将扩增产物与植物非冗余核酸数据库进行blastn比对分析，结果表明bvre105的扩增产物与甜菜一条未知功能的序列相似，相似部分为扩增片段的第1-175bp，该部分的序列相似性为99％。

根据序列相似性将标记在甜菜基因组中进行定位，结果表明bvre105定位于甜菜基因组中7号染色体的39071516-39071279区域。

序列表

<110>黑龙江大学

<120>一种检测甜菜种子粒性的ssr分子标记bvre105及其应用

<160>6

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物bvre105s

<400>1

tcaccaggattaaccaagcc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物bvre105a

<400>2

acttccacgtctttgcaacc20

<210>3

<211>219

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>单粒相关条带对应扩增序列

<400>3

aaggcaaggaacagaagcagcagtcttaatcatttgtggagcttcagtaatgataactgg60

agaacctatgcttaacttagatgcatctctctttggtacttctgcagaaaaatcttgttc120

attcagctcacacttggaagtaaaatctcgggttcgagttcgagttcgagttcgagttcg180

agtttgaaatccaatattaggttgcaaagacgtggaagt219

<210>4

<211>207

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>多粒相关条带1对应扩增序列

<400>4

aaggcaaggaacagaagcagcagtcttaatcatttgtggagcttcagtaatgataactgg60

agaacctatgcttaacttagatgcatctctctttggtacttctgcagaaaaatcttgttc120

attcagctcacacttggaagtaaaatctcgggttcgagttcgagttcgagtttgaaatcc180

aatattaggttgcaaagacgtggaagt207

<210>5

<211>231

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>多粒相关条带2对应扩增序列

<400>5

aaggcaaggaacagaagcagcagtcttaatcatttgtggagcttcagtaatgataactgg60

agaacctatgcttaacttagatgcatctctctttggtacttctgcagaaaaatcttgttc120

attcagctcacacttggaagtaaaatctcgggttcgagttcgagttcgagttcgagttcg180

agttcgagttcgagtttgaaatccaatattaggttgcaaagacgtggaagt231

<210>6

<211>279

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>多粒相关条带3对应扩增序列

<400>6

aaggcaaggaacagaagcagcagtcttaatcatttgtggagcttcagtaatgataactgg60

agaacctatgcttaacttagatgcatctctctttggtacttctgcagaaaaatcttgttc120

attcagctcacacttggaagtaaaatctcgggttcgagttcgagttcgagttcgagttcg180

agttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcgagttcg240

agtttgaaatccaatattaggttgcaaagacgtggaagt279