一种同步检测水稻粒宽基因GW5和GW8的试剂盒及多重PCR检测方法与流程

本发明涉及一种同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的试剂盒及多重pcr检测方法，属于农业生物技术领域。

背景技术：

水稻产量由每株穗数、穗粒数、千粒重构成，其中千粒重是重要的籽粒性状，受籽粒粒型的影响，同时粒型还直接影响稻米品质。水稻粒型是由粒长、粒宽和长宽比构成的维立体结构，是一个复杂的农艺性状。水稻粒宽属于数量性状，受胚、胚乳及母体植株等不同遗传体系的控制。通过优化粒宽基因，可以大大提升稻米产量和品质。

gw5基因是控制水稻粒宽的一个主效，有研究将gw5定位于第5染色体，通过改变籽粒外颖细胞数来调节粒宽。该基因在2个亲本中存在1212bpindel变异，日本晴的该基因存在1212bp的缺失，进而导致该基因功能的缺失。将窄粒型籼稻kasalath等位基因的1212bp转化到宽粒型粳稻日本晴中，发现日本晴粒宽明显变窄，表明缺失型的宽粒表型为隐性性状。

gw8基因是以水稻品种basmati385为供体亲本和华粳籼74为受体亲本构建的分离群体定位发现的，在第8染色体长臂rm502和psm711区间约7.5kb范围内。gw8是通过调控细胞周期基因的表达从而影响颖壳细胞数、促进横向的细胞增殖来增加籽粒宽度，gw8的过表达可促进细胞分裂，加快籽粒灌浆速率。该基因含3个外显子，华粳籼74的gw8基因启动子区10bp序列(gagctgagct)的存在，对于该基因在幼穗中的正常表达起着重要的作用，从而增加了籽粒的粒宽。basmati385的gw8基因启动子区存在10bp序列的缺失，导致该基因表达降低，粒宽变小。

现有技术中对gw5和gw8基因的研究比较多，申请公布号为cn107058493a的中国发明专利申请公开了一种检测水稻粒宽gw5等位基因的特异性pcr分子标记。公开号cn102329806b的中国发明专利公开了控制水稻粒宽、粒重和产量的基因gw8及其应用，其技术方案中明确了gw8可以作为鉴定水稻籽粒长宽比和籽粒大小品种的分子标记。上述两个中国发明专利分别明确了gw5基因和gw8基因的功能，并提出了可利用的分子标记。目前并未见同时对gw5和gw8两个粒宽基因进行筛选鉴定的方法。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的试剂盒，该试剂盒可以同步检测水稻gw5和gw8基因的粒宽。

本发明还提供一种同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的多重pcr检测方法，该方法一次pcr反应就能同时检测两个目标基因，其重复性好、成本低。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的试剂盒，包括gw5基因的特异性引物和gw8基因的特异性引物；

所述gw5基因的特异性引物为：

gw5-f：5′-gtcggtcgttggaggca-3′，

gw5-r：5′-gggactatgtgggataggat-3′；

所述gw8基因的特异性引物为：

gw8-f：5′-aaagagacagccacggaatc-3′，

gw8-r：5′-atcttgagatcccactccat-3′。

该试剂盒中的gw5基因的特异性引物和gw8基因的特异性引物稳定性好，扩增产量高，可特异性的扩增水稻粒宽基因gw5和gw8。

所述同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的试剂盒，还包括2×taqmastermix、dnamarker，利用该试剂盒可以实现在1个反应体系中同时检测2个基因。

一种同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的多重pcr检测方法，包括以下步骤：以水稻基因组dna为模板，利用gw5基因的特异性引物和gw8基因的特异性引物进行多重pcr扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后，根据特征条带判定结果；

所述gw5基因的特异性引物为：

gw5-f：5′-gtcggtcgttggaggca-3′，

gw5-r：5′-gggactatgtgggataggat-3′；

所述gw8基因的特异性引物为：

gw8-f：5′-aaagagacagccacggaatc-3′，

gw8-r：5′-atcttgagatcccactccat-3′。

上述同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的多重pcr检测方法，一次pcr反应即能检测两个目标基因，简化了操作步骤、缩短了检测时间，同时提高了检测效率。

所述多重pcr扩增的反应体系为：2×taqmastermix10μl，50ng/μl水稻基因组dna2μl，10ng/μlgw5基因特异性引物gw5-f、gw5-r各1μl，10ng/μlgw8基因特异性引物gw8-f、gw8-r各1μl，ddh2o4μl，在该反应体系下酶和基因组dna以及基因特异性引物的反应更充分，扩增产物的特异性更高。

所述多重pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存，该反应程序下引物和目的基因序列杂交的稳定性更好，无引物二聚体和非特异性产物形成。

所述凝胶电泳为：6％聚丙烯酰胺凝胶中、50w功率下电泳1h，在该电泳条件下的扩增条带更清晰。

所述根据特征条带判定结果的具体方法为：gw5基因型判定：当扩增出1938bp特征条带时，判定该品种gw5基因为野生型；当扩增出726bp特征条带时，判定该品种gw5基因为缺失型；gw8基因型判定：当扩增出161bp特征条带时，判定该品种gw8基因为野生型；当扩增出151bp特征条带时，判定该品种gw8基因为缺失型；由gw5基因型判定结果和gw8基因型判定结果可以判定稻谷粒宽。

通过上述根据特征条带判定结果的方法可快速、高效、低成本的检测水稻粒宽基因，为水稻优质高产品种的分子标记辅助育种和品种改良提供了依据。

附图说明

图1为本发明gw5基因缺失片段及引物序列所处位置的示意图；

图2为本发明gw8基因缺失片段及引物序列所处位置的示意图；

图3为本发明同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的多重pcr检测方法的实施例中1～29位水稻材料的电泳图；

图4为中本发明同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的多重pcr检测方法的实施例中30～58位水稻材料的电泳图；

图3中，m代表dnamarker，a～d依次代表gw5基因缺失型对照材料日本晴、gw5基因插入型对照材料黄花占，gw8基因缺失型对照材料日本晴，gw8基因插入型对照材料黄花占；

图4中，m代表dnamarker，a～d依次代表gw5基因缺失型对照材料日本晴、gw5基因插入型对照材料黄花占，gw8基因缺失型对照材料日本晴，gw8基因插入型对照材料黄花占。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。

若无特殊说明，下述实施例中所用技术手段均为本领域技术人员熟知，所用仪器、试剂盒、水稻材料均为市售或育种常见品种。

同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的试剂盒的实施例

本实施例的同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的试剂盒，包括gw5基因的特异性引物和gw8基因的特异性引物；

gw5基因的特异性引物为：

gw5-f：5′-gtcggtcgttggaggca-3′，

gw5-r：5′-gggactatgtgggataggat-3′；

gw8基因的特异性引物为：

gw8-f：5′-aaagagacagccacggaatc-3′，

gw8-r：5′-atcttgagatcccactccat-3′。

gw5基因缺失片段及引物序列所处位置如图1所示，gw8基因缺失片段及引物序列所处位置如图2所示。

本实施例的同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的试剂盒，还包括2×taqmastermix(2×taqmastermix包括以下组分：taqdnapolymerase0.1u/μl、2×pcrbuffer、3mmmg²⁺、0.4mmdntps)50ml，dnamarker200020ml，ddh2o100ml，以及10ng/μl的gw5特异性引物gw5-f、gw5-r各1ml和10ng/μl的gw8特异性引物gw8-f、gw8-r各1ml。

同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的多重pcr检测方法的实施例

本实施例的同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的多重pcr检测方法，包括以下步骤：

1)材料准备

待鉴定材料共58个。1～58位依次为徐稻3号、垦育808、徐32646、盐稻1333、苑丰136、w023、皖垦粳2181、宏稻59、隆粳99、sh1427、中作13264、皖垦糯893、乐播1号、科粳稻1号、w037、津粳优2186、盐稻15198、圣012、扬粳508、中作13147、赛粳988、信粳1787、圣糯1号、淮116、苏秀226、镇稻9304、宁6618、金稻14-153、灵谷糯6号、象牙香占、粤晶丝苗2号、五山丝苗、金丝苗2号、粤银占、黄花占、合丰占、盐糯12号、武运糯6号、武育糯16号、澄粳216、南粳9108、黑香糯、红米、黑稻、镇稻99、盐丰稻2号、津稻372、金粳698、豫稻16、豫稻17、豫农粳6号、豫农粳11号、圣稻20、水晶3号、黄金晴、豫农粳12号、玉稻518、新稻18。gw5和gw8基因均以缺失型品种日本晴和插入型品种黄花占为对照。

2)水稻基因组dna的提取

利用水培法培养水稻幼苗至1叶1心，采用常规sls法提取各材料叶片的dna，具体步骤如下：取适量新鲜叶片于预冷的研钵中，用液氮研磨至粉末状，然后转移至2ml离心管中，加入600μlsls提取液(65℃预热)，65℃水浴30min，每隔5min颠倒混匀数次；然后加入400μl氯仿：异戊醇(体积比为24:1)混合液，轻柔混摇15min，12000g离心8min；再将上清液转移至另一1.5ml无菌离心管中，加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，混匀后于-20℃静置30min；然后再12000g离心10min后弃上清，用无水乙醇漂洗2次，短暂离心后除去残余乙醇，晾干；最后加入100μlte缓冲液溶解dna，贮存于-20℃备用。

3)引物设计

从ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载水稻基因gw5和gw8的基因序列，利用bioedit软件对差异序列比对分析，利用primerpremier5.0软件设计引物，gw5和gw8基因的引物序列如下所示。gw5基因的差异在于1212bp的插入/缺失，在其缺失序列两侧设计引物，预计pcr产物大小为：插入型1938bp，缺失型726bp；gw8的差异为基因启动子区10bp(gagctgagct)的插入/缺失，在该10bp上游100bp内设计正向引物，下游100bp内设计反向引物，预计插入型的pcr产物大小为161bp，缺失型为151bp。

gw5-f：5′-gtcggtcgttggaggca-3′，

gw5-r：5′-gggactatgtgggataggat-3′。

gw8-f：5′-aaagagacagccacggaatc-3′，

gw8-r：5′-atcttgagatcccactccat-3′。

上述gw5和gw8基因的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，均加ddh2o配制为10ng/μl的浓度。

4)多重pcr扩增

以步骤2)提取的水稻基因组dna为模板，利用水稻粒宽基因gw5的特异性引物gw5-f/gw5-r和gw8的特异性引物gw8-f/gw8-r进行多重pcr扩增，扩增产物经凝胶电泳分析后，根据特征条带判定结果。

多重pcr扩增的反应体系为：2×taqmastermix10μl，50ng/μl水稻基因组dna2μl，10ng/μlgw5基因特异性引物gw5-f、gw5-r各1μl，10ng/μlgw8基因特异性引物gw8-f、gw8-r各1μl，ddh2o补足至20μl。

多重pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

凝胶电泳的条件为：6％聚丙烯酰胺凝胶电泳、50w功率下电泳1h，银染显色并拍照。

5)结果判定与分析

根据特征条带判定结果的方法为：gw5基因型判定：当扩增出1938bp特征条带时，判定该品种gw5基因为插入型；当扩增出726bp特征条带时，判定该品种gw5基因为缺失型；gw8基因型判定：当扩增出161bp特征条带时，判定该品种gw8基因为插入型；当扩增出151bp特征条带时，判定该品种gw8基因为缺失型。

由图3可看出，1～29位水稻品种中，gw5和gw8基因双插入型的品种为第16位的津粳优2186，津粳优2186为粳稻亚种，由图4可看出，gw5和gw8基因双插入型的品种为从30～36位，依次为象牙香占、粤晶丝苗2号、五山丝苗、金丝苗2号、粤银占、黄花占和合丰占，30-36号的7个水稻品种为籼稻品种，粒宽在1.95mm至2.35mm，籽粒较窄。gw5基因为缺失型而gw8基因为插入型的只有第13位的乐播1号和盐稻15198两个品种。其余48个品种均为gw5和gw8双缺失型的品种，占供试品种的82.76％。所有供试品种中，未检测到gw5插入型而gw8为缺失型的品种。

被检测的58个品种中，gw5和gw8缺失型的分布频率要大大高于两基因插入型的分布频率。籼稻品种都为gw5和gw8双插入型，具有较窄的籽粒宽度，大部分粳稻为gw5和gw8缺失型，籽粒普遍较宽。

在实际的育种工作中，可根据不同的育种目标，可通过聚合粒宽基因数目和调控粒宽基因的组合方式来实现，如需培育宽粒型品种，可选用徐稻3号、南粳9108、新稻18等品种作为亲本，窄粒型粳稻可选用津粳优2186、乐播1号或象牙香占籼稻品种为亲本。

序列表

<110>河南农业大学

<120>一种同步检测水稻粒宽基因gw5和gw8的试剂盒及多重pcr检测方法

<170>siposequencelisting1.0

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<221>引物gw5-f

<400>1

gtcggtcgttggaggca17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<221>引物gw5-r

<400>2

gggactatgtgggataggat20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<221>引物gw8-f

<400>3

aaagagacagccacggaatc20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<221>引物gw8-r

<400>4

atcttgagatcccactccat20